基于UHPLC-HRMS/MS的口腔液90种新型精神活性物质靶向筛查方法的开发与验证

《Biology》：A Comprehensive HPLC-HRMS/MS Targeted Screening Method to Detect 90 New Psychoactive Substances in Oral Fluid Samples Ilaria Spinella, Fabio Altieri, Simona Pichini, Adele Minutillo and Annagiulia Di Trana

针对新型精神活性物质(NPS)层出不穷、现有方法覆盖不全的难题，本研究开发了可同时检测口腔液(OF)中90种NPS的UHPLC-HRMS/MS靶向筛查法。该方法采用“稀释-进样”策略，11分钟内完成分离，灵敏度高(LOI低至1 ng/mL)，经21份真实样本验证准确率达90.5%，为急诊、路检及法医鉴定提供了高效工具。

　　

深夜的急诊室里，一位年轻人因突发意识障碍被送来急救，家属坚称他只喝了点酒，但经验丰富的医生却怀疑另有隐情——这种场景在全球各地的医疗机构中越来越常见。罪魁祸首往往是一类被称为“新型精神活性物质”(New Psychoactive Substances, NPS)的化合物。它们像是毒品世界里的“变形金刚”，不断改头换面，从合成大麻素(Synthetic Cannabinoid Receptor Agonists, SCRAs)到合成卡西酮(Synthetic Cathinones, SCs)，再到近年来令人闻风丧胆的硝基唑仑类(nitazenes)等合成阿片类，目前已超过1000种。这些物质的药理学特性极不稳定，毒性难以预测，且由于法律监管的滞后性，常处于灰色地带。对于法医毒理学家和临床医生而言，如何在复杂的生物样本中快速、准确地识别这些“伪装者”，成为了捍卫公共健康的一大挑战。传统的检测方法往往只能覆盖少数几种物质，面对层出不穷的新结构类似物（尤其是同分异构体）时常常束手无策，导致漏检误判，延误治疗或司法公正。

为了解决这一燃眉之急，来自意大利的研究团队Ilaria Spinella, Fabio Altieri, Simona Pichini, Adele Minutillo和Annagiulia Di Trana在《Biology》期刊上发表了一项重要成果。他们开发并验证了一种基于超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱(Ultra-High-Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry/Mass Spectrometry, UHPLC-HRMS/MS)的靶向筛查方法，能够一次性在口腔液(Oral Fluid, OF)中检测多达90种NPS。这项研究不仅填补了针对最新高风险物质（如orphines和新型合成大麻素）检测方法的空白，更为道路安全执法、急诊中毒处置和法医调查提供了一个强有力的技术武器。

为了实现这一目标，研究人员采用了几项关键技术方法。首先是样本队列来源，研究使用了10名健康捐赠者的空白口腔液，以及8份既往储存的研究样本和13份来自实验室间外部质量控制计划(ORALVEQ)的真实样本。其次是样品制备，采用了简化的“稀释-进样”(dilute-and-shoot)策略，将口腔液与流动相按1:2的体积比稀释，涡旋离心后直接进样，避免了繁琐的固相萃取或液液萃取步骤。核心检测技术则是利用双苯基色谱柱进行11分钟的梯度洗脱分离，结合Q Exactive? Focus四极杆-轨道阱混合质谱仪，在正离子模式下采用全扫描/数据依赖二级质谱(Full MS/ddMS²)模式采集数据，并通过包含目标离子和保留时间的包含列表进行定性筛查。方法验证严格遵循ANSI/ASB Standard 036指南，评估了基质干扰、特异性、识别限(Limit of Identification, LOI)和残留效应。

3.1. 方法开发

研究人员首先优化了色谱和质谱条件。通过直接注射单个分析物溶液，确定所有物质的最佳前体离子均为氢加合物[M+H]⁺。随后筛选了阶梯式归一化碰撞能量(Normalized Collision Energy, NCE)为20、35和65，以获得最具信息量的碎片图谱。在色谱方面，比较了不同色谱柱和流动相组成，最终选定Force Inert Biphenyl色谱柱，并在11分钟内完成了90种物质的良好分离。根据保留时间(Retention Time, Rt)，所有分析物被分为8个工作组(Working Groups, WGs)，以便在质谱采集中设置不同的采集窗口，提高检测效率。样品制备的稀释比例经过测试，最终确定1:2 (v/v)为最佳稀释比，既能保证良好的峰形，又能有效降低基质效应。

3.2. 方法验证

在严格的验证过程中，研究人员评估了多项性能指标。基质干扰测试分析了10份空白口腔液样本，未发现干扰目标分析物定性的色谱峰。特异性评估显示各分析物之间无交叉干扰。灵敏度方面，测定了识别限(LOI)。在最优的1:2稀释条件下，44.4%的分析物LOI达到1 ng/mL，37.8%达到5 ng/mL，其余化合物的LOI在10至100 ng/mL之间。值得注意的是，大部分分析物的信噪比(S/N)表现优异。残留测试表明，高浓度样本（100 ng/mL）后进样的空白样本中未检测到残留信号，证明了方法的可靠性。

3.3. 真实口腔液样本分析

为了检验方法的实战能力，研究团队将其应用于21份真实口腔液样本。结果显示，5份空白样本被正确识别，整体准确率达到90.5%（19/21）。其中，仅出现1例假阳性和1例假阴性（样本OF21），另有1例样本（OF18）含有两种NPS但仅检出一种，属于部分阳性。此外，有5份样本检测出非本方法验证范围内的物质，因此判定为阴性。该结果表明该方法在实际应用场景中具有很高的有效性。

这项研究的成功开发，标志着NPS检测技术向前迈进了一大步。其最大的亮点在于兼顾了“广度”与“速度”。首先，覆盖的90种物质囊括了目前全球市场上最主流的几大类NPS，特别是纳入了如brorphine（orphine类）、α-PHiP和MDPHP等高风险的新型物质，这在同类方法中尚属首次。其次，采用“稀释-进样”的前处理方式极具临床和法医实用价值。相比于传统的微萃取(MEPS)或液液萃取(LLE)，这种方法省去了复杂的净化步骤，仅需100 μL口腔液，极大缩短了样本处理时间，降低了分析成本，非常适合高通量筛查。再者，高分辨质谱(HRMS)的应用是解决NPS鉴定难题的关键。它能够通过精确质量数测量和二级碎片图谱，有效区分结构相似甚至同分异构的化合物，例如成功分离了α-PHP和α-PHiP，以及顺式和反式3-甲基去甲芬太尼，这是普通三重四极杆质谱难以做到的。虽然该方法在部分合成大麻素上的灵敏度(LOI 10-100 ng/mL)略低于某些特定方法，但考虑到这类物质通常摄入量较大，且口腔液中浓度通常高于LOI，这并不影响其在筛查中的应用价值。对于高毒性的合成阿片类，绝大多数LOI达到了1 ng/mL，足以应对痕量检测的需求。尽管研究存在一定的局限性，例如无法准确定量，且对于某些共流出的位置异构体（如3-MMC和4-MMC）仍需后续确证，但这并不掩盖其作为一款优秀筛查工具的潜力。随着NPS市场的持续演变，该方法凭借灵活的扩展性，可以方便地加入新的目标物，无需大幅改动前处理和色谱条件，将持续为公共卫生安全和司法公正保驾护航。