弓形虫TgJosephin与TgRad23通过去泛素化SPM1介导抗IFN-γ毒力的机制研究

《mSphere》：TgJosephin and TgRad23 are important for anti-IFN-γ virulence via deubiquitination of SPM1 in Toxoplasma

本研究旨在揭示弓形虫(Toxoplasma gondii)非分泌性蛋白在抑制宿主IFN-γ免疫中的新机制。研究人员通过CRISPR/Cas9筛选及功能实验，发现去泛素化酶TgJosephin及其调控蛋白TgRad23是关键的毒力因子，其通过调控微管相关蛋白SPM1的去泛素化来维持病原体在小鼠体内的毒力。该工作揭示了一条由胞内蛋白介导的抗宿主免疫新通路，为深入理解弓形虫致病机理提供了新视角。

　　

作为一种专性细胞内寄生原虫，弓形虫(Toxoplasma gondii)几乎能感染所有的温血动物，全球约三分之一的人口携带其感染。尽管多数人感染后无明显症状，但对于孕妇或免疫功能低下者，弓形虫病可导致严重的后果，甚至危及生命。因此，深入揭示弓形虫的致病机制，对于该病的防治具有重要意义。在感染宿主细胞后，弓形虫会形成一个称为纳虫空泡(parasitophorous vacuole, PV)的结构，在其中进行增殖。宿主细胞，特别是小鼠细胞，会通过产生干扰素-γ (interferon-gamma, IFN-γ) 来启动细胞自主免疫，例如募集免疫相关的GTP酶(IRG)到PV膜上破坏其完整性，或通过诱导一氧化氮合酶(iNOS)产生一氧化氮、通过吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)降解色氨酸来抑制寄生虫生长。为了对抗宿主的这些防御，高毒力弓形虫株会分泌一系列毒力因子，例如从棒状体和致密颗粒释放的蛋白质，以抑制宿主的免疫反应。然而，过去的研究大多聚焦于这些分泌蛋白，对于那些不分泌到宿主细胞、但可能同样在寄生虫内部调控毒力的“非分泌性”蛋白，其作用机制仍是一个巨大的知识盲区。是否存在这样一类蛋白，它们不直接与宿主因子相互作用，却在寄生虫内部精密调控着其逃避宿主IFN-γ免疫反应的能力？解答这个问题，将为我们绘制更完整的弓形虫毒力图谱提供关键拼图。

为了解决上述问题，一支研究团队在《mSphere》杂志上发表了一项研究。他们从一个前期工作——利用野生型和IFN-γ受体(IFNγR)缺陷型小鼠进行的体内CRISPR筛选结果出发，将目光投向了几个排名靠前、但被预测定位于寄生虫细胞核或细胞质的候选基因。这些基因编码的蛋白不太可能像传统毒力因子那样直接分泌并作用于宿主，这暗示着弓形虫内部可能存在未知的、调控免疫逃逸的分子通路。研究人员最终聚焦于四个候选蛋白：TgRqc2、TgRad23、TgJosephin和TgCapZB，并利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术分别构建了它们的基因敲除虫株。通过一系列体内外实验，他们发现TgJosephin（一种高度保守的去泛素化酶）和TgRad23（一个参与DNA修复和蛋白质转运的蛋白）是弓形虫抵抗宿主IFN-γ免疫的关键新型毒力因子，并深入阐释了它们通过调控微管蛋白SPM1的泛素化状态来发挥作用的分子机制。这项研究不仅鉴定出新的毒力因子，更揭示了一条由寄生虫内部“家务”蛋白介导的抗IFN-γ免疫新通路，拓展了我们对病原体-宿主互作复杂性的认知。

在技术方法上，该研究主要运用了基于CRISPR/Cas9的体内筛选和基因敲除技术来鉴定和验证毒力相关基因。研究人员利用小鼠感染模型（包括野生型、IFNγR缺陷型、iNOS缺陷型和IDO缺陷型小鼠）系统评估了不同基因敲除虫株的毒力变化。通过蛋白质免疫印迹(Western blot)、免疫共沉淀、免疫荧光和定量蛋白质组学（特别是靶向泛素化的质谱分析）等技术，研究了蛋白表达、互作及翻译后修饰的变化。此外，还采用了斑块形成、复制、侵袭、逸出等体外功能实验，以及超微结构扩展显微镜(U-ExM)来观察微管形态。

TgRad23和TgJosephin的缺失降低了体内毒力

研究人员首先验证了筛选结果。他们发现，尽管TgRqc2、TgRad23、TgJosephin的敲除并不影响弓形虫在正常小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的复制能力，但在小鼠脚垫感染模型中，与野生型或ΔTgRqc2虫株感染的、全部在17天内死亡的小鼠相比，感染ΔTgRad23或ΔTgJosephin虫株的小鼠生存期显著延长。这表明TgRad23和TgJosephin是新型的抗IFN-γ毒力因子。

TgJosephin和TgRad23对抑制IFN-γ依赖性免疫至关重要

为了明确其作用是否特异于IFN-γ通路，研究人员用ΔTgJosephin或ΔTgRad23虫株分别感染野生型小鼠和IFNγR缺陷型小鼠。结果发现，在IFNγR缺陷型小鼠中，这两种突变株的毒力与野生型弓形虫无异，所有小鼠均在17天内死亡；而在野生型小鼠中，感染突变株的小鼠则能存活超过20天。这强有力地证明TgJosephin和TgRad23的功能是特异性地抑制宿主的IFN-γ介导的免疫。进一步实验发现，在TgRad23缺陷型虫株中，带有HA标签的内源性TgJosephin蛋白水平显著降低，表明TgRad23对于维持TgJosephin的蛋白丰度是必需的。

TgJosephin抑制一条不依赖于IRG的免疫通路

那么TgJosephin是如何抑制IFN-γ免疫的呢？研究人员首先检测了IFN-γ诱导的宿主因子在纳虫空泡(PV)膜上的募集情况。结果显示，与野生型虫株相比，ΔTgJosephin虫株的PV膜上IRGB6、IRGA6、p62、GBP1、GBP2、GBP1-5等蛋白的负载量并未增加。这表明TgJosephin的免疫抑制机制独立于IFN-γ诱导的GTPases对PV的包被和破坏。随后，他们比较了ΔTgJosephin虫株在野生型、IFNγR缺陷型、iNOS缺陷型和IDO缺陷型小鼠中的毒力。感染30天后，80%的野生型小鼠存活，而所有IFNγR缺陷型小鼠死亡，iNOS和IDO缺陷型小鼠的存活率分别降至33%和50%。这些结果提示，TgJosephin主要是通过抑制由iNOS介导的生长抑制功能来发挥作用的。

去泛素化酶催化结构域对TgJosephin介导的毒力很重要

TgJosephin属于Josephin家族蛋白，具有保守的催化结构域（Josephin domain）。为了确认其去泛素化酶活性是否关键，研究人员通过序列比对找到了与人类同源蛋白活性位点半胱氨酸对应的TgJosephin第24位半胱氨酸(C24)，并将其突变为丝氨酸(C24S)。体内实验表明，用野生型TgJosephin回补ΔTgJosephin虫株可完全恢复毒力，所有感染小鼠在16天内死亡；而用酶活缺陷的TgJosephin^C24S回补的虫株，其毒力仅得到部分恢复，小鼠可存活20-30天。这证明TgJosephin的去泛素化酶活性是其发挥免疫抑制功能的关键。

TgJosephin缺陷型虫株中SPM1的泛素化增加

接下来，研究人员利用靶向泛素化的质谱分析，在野生型和ΔTgJosephin虫株中寻找差异泛素化的底物蛋白。他们发现，在ΔTgJosephin虫株中，泛素化水平升高最显著的蛋白是微管相关蛋白SPM1 (subpellicular microtubule protein 1)。而通过数据非依赖采集(DIA)进行的定量蛋白质组学显示，SPM1的蛋白总量并无变化，表明TgJosephin的缺失影响的是SPM1的泛素化修饰，而非其降解或表达。

SPM1的泛素化影响TgJosephin缺陷型虫株的毒力

为了探究SPM1泛素化在毒力中的意义，研究人员构建了SPM1基因敲除(Δspm1)以及SPM1与TgJosephin双敲除(DKO)虫株，并分别用野生型SPM1或一个将所有已检测到的泛素化靶点赖氨酸突变为精氨酸的突变体SPM1^KR进行回补。有趣的是，单纯缺失SPM1仅导致虫株毒力轻微下降，且SPM1和SPM1^KR都能同等程度地回补这一缺陷。然而，在更为关键的实验中，研究人员用缺失TgJosephin的虫株（DKO）分别回补SPM1或SPM1^KR后感染小鼠。结果发现，所有感染表达野生型SPM1虫株的小鼠均存活超过30天，而感染表达SPM1^KR（无法被泛素化）虫株的小鼠则在20天内全部死亡。这表明，在缺乏TgJosephin的情况下，SPM1的泛素化会损害弓形虫的毒力；而当SPM1的泛素化位点被突变后，即使没有TgJosephin，寄生虫的毒力也能得到部分恢复。

综上所述，这项研究鉴定出弓形虫的非分泌性蛋白TgJosephin是一个依赖于其去泛素化酶活性的新型毒力因子，其蛋白稳定性由TgRad23维持。TgJosephin通过去泛素化微管蛋白SPM1，抑制了一条不依赖于IRG/GBP的IFN-γ免疫通路（很可能与iNOS介导的途径相关），从而帮助弓形虫在小鼠体内维持毒力。当TgJosephin缺失时，SPM1发生过度的泛素化，这种异常修饰的SPM1反而成为毒力的阻碍。该研究的核心结论是，在弓形虫内部存在一个由TgRad23-TgJosephin-SPM1构成的分子轴，专门用于对抗宿主的IFN-γ免疫反应。这一发现具有多重重要意义：首先，它将弓形虫毒力因子的研究范畴从传统的分泌蛋白拓展至寄生虫内部的“家务”蛋白，揭示了病原体利用保守的细胞进程（如泛素化修饰、微管稳定性调控）来实现免疫逃逸的新策略。其次，它阐明了一条全新的、独立于已知IRG/GBP通路之外的抗IFN-γ机制，丰富了我们对宿主-弓形虫攻防战复杂性的理解。最后，TgJosephin和TgRad23在哺乳动物中具有同源蛋白，这使得该通路成为一个潜在的、具有物种交叉研究价值的模型，不仅为弓形虫病的防治提供了新的潜在靶点，也可能为理解相关人类蛋白的功能及疾病（如由ataxin-3突变引起的马查多-约瑟夫病）提供启示。这项研究充分表明，深入探究病原体内部的基础生物学过程，是全面揭示其致病机制不可或缺的一环。