基于等温扩增和侧向流动检测技术消除DNA甲基化分析中的残留污染

《Analytica Chimica Acta》：Elimination of carryover contamination for DNA methylation analysis based on isothermal amplification and lateral flow assay

DNA甲基化检测中，基于环介导等温扩增（LAMP）和末端脱氧核苷酸转移酶（dITP）标记的策略可有效消除交叉污染，结合横向流试纸条（LFD）实现快速可视化检测，验证了其与吡咯定量测序法的一致性，为早期癌症诊断提供新方法。

　　

刘晓楠|张嘉兴|胡文静|周慧云|贾娟|严江伟

山西医科大学法医学学院，太原，030001，中国

摘要

背景

异常DNA甲基化是肿瘤发生的重要预后指标，使其成为癌症早期诊断的有希望的生物标志物。尽管亚硫酸盐转化结合核酸扩增可以提供高灵敏度来检测微量肿瘤DNA，但不可避免地会出现交叉污染，这与灵敏度存在冲突。此外，基于尿嘧啶-DNA糖基化酶的策略不适用于以亚硫酸盐转化后的DNA为模板的气溶胶消除。在基于亚硫酸盐转化的DNA甲基化分析方法中，由于交叉污染仍会导致假阳性结果。因此，这些缺陷突显了需要采用另一种序列分析策略的必要性。

结果

在这项研究中，我们开发了一种基于DNA损伤修复机制的新策略来消除交叉污染，适用于亚硫酸盐转化后的DNA分析。我们采用了环介导等温扩增（LAMP）来检测DNA甲基化，忽略了由于高灵敏度和大量扩增子而导致的交叉污染倾向。通过在扩增过程中引入脱氧肌苷三磷酸（dITP），扩增子被标记上羟黄嘌呤。随后，含有羟黄嘌呤的扩增子作为气溶胶可以被内切酶V识别并切除，而缺乏羟黄嘌呤的亚硫酸盐转化DNA则不受影响。此外，我们组装了一种侧向流动装置（LFD），作为一种快速方便的可视化结果解读策略，忽略了开放容器引起的气溶胶扩散问题。使用10个实际样本验证了该方法对miR-34a启动子区域DNA甲基化状态的检测结果，其结果与焦磷酸测序的结果一致。

意义

我们开发了一种新的交叉污染消除策略，并将其集成到基于LAMP的侧向流动生物传感器中，用于DNA甲基化分析。这一策略解决了交叉污染与灵敏度之间的矛盾，有助于检测微量DNA甲基化。LFD可用于可视化结果解读，便于现场检测。作为一种通用策略，该方法可以轻松扩展到其他生物标志物，为癌症的早期诊断提供有力支持。

引言

作为最广泛的表观遗传形式，DNA甲基化在生物体的生长和发育过程中是可变的，是基因表达调控的重要机制。当生物体暴露在恶劣环境中时，DNA甲基化状态会相应改变以应对环境压力。然而，某些异常甲基化会失控并干扰基因表达，导致细胞代谢紊乱和相应疾病（如癌症）[1]、[2]。因此，癌症相关基因上的异常DNA甲基化是肿瘤发生的重要预后指标。早期确诊可以有效促进癌症的治疗和预后，提高生存率。由于蛋白质是由mRNA翻译而来的，而RNA表达受DNA甲基化调控，因此DNA甲基化的异常比蛋白质和RNA更早出现，这使得DNA甲基化成为尽早诊断癌症的有希望的生物标志物[3]、[4]、[5]。然而，异常DNA甲基化会混杂在大量正常分子或细胞中，导致在液体活检或组织活检中难以准确诊断，尤其是在早期癌症阶段肿瘤DNA含量极少的情况下[6]、[7]。因此，对于DNA甲基化检测来说，极高的灵敏度和特异性是非常需要的。

通过核酸扩增，可以检测到微量目标物质。然而，DNA甲基化不能与核酸一起被扩增，且在扩增过程中DNA甲基化状态会丢失。为了基于核酸扩增分析DNA甲基化，人们开发了内切酶消化和亚硫酸盐转化方法[8]、[9]。由于缺乏敏感的甲基化限制性内切酶，基于内切酶消化的方法无法分析任何期望的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（CpG）序列。而基于亚硫酸盐转化的方法可以通过脱氨基作用将胞嘧啶转化为尿嘧啶，同时保持甲基胞嘧啶不变，从而将DNA甲基化差异转化为单碱基差异。通过后续的核酸扩增进行序列分析，可以识别目标DNA甲基化。因此，基于亚硫酸盐转化的方法被认为是最权威的DNA甲基化分析方法。目前，序列分析主要采用针对目标序列的双引物PCR。由于亚硫酸盐转化后的DNA模板中缺乏胞嘧啶，DNA序列的差异减小，引物容易发生错配，降低了特异性[10]。因此，PCR的特异性难以满足高度异质性肿瘤样本的分析需求。此外，PCR的灵敏度也难以检测到微量肿瘤DNA。因此，这些缺陷突显了需要采用另一种序列分析策略的必要性。

通过使用六种高浓度引物针对八个区域，环介导等温扩增（LAMP）不仅具有更高的灵敏度和特异性，还能产生更多扩增子，使其成为基于亚硫酸盐转化的DNA甲基化分析的理想策略[11]。在核酸扩增过程中，之前的扩增子容易形成气溶胶并污染后续扩增[12]。这种交叉污染不可避免地导致假阳性结果，而LAMP的高灵敏度和大量扩增子进一步加剧了这一问题[13]。基于尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）的策略已被广泛用于核酸扩增中的交叉污染消除。通过在扩增过程中引入脱氧尿苷三磷酸（dITP），扩增子被标记上尿嘧啶。含有尿嘧啶的扩增子作为气溶胶可以被UDG特异性识别并在后续反应中降解，而不含尿嘧啶的天然DNA模板则不受影响。因此，基于UDG的抗气溶胶策略无法集成到基于亚硫酸盐转化的方法中，因为含有尿嘧啶的扩增子和亚硫酸盐转化后的DNA都会被UDG水解。迄今为止，还没有能够消除含尿嘧啶DNA分析中交叉污染的策略，基于亚硫酸盐转化的DNA甲基化检测中仍然存在假阳性结果。

在这项研究中，我们开发了一种新的交叉污染消除策略，并将其集成到基于LAMP的侧向流动生物传感器中，用于DNA甲基化分析。通过亚硫酸盐转化产生的单碱基差异来识别DNA甲基化状态。通过在LAMP过程中引入脱氧肌苷三磷酸（dITP），扩增子被标记上羟黄嘌呤。尽管含有羟黄嘌呤的扩增子会形成气溶胶并污染后续扩增，但羟黄嘌呤作为受损碱基会被内切酶V识别并切除。而缺乏羟黄嘌呤的亚硫酸盐转化DNA则不受影响。因此，LAMP中交叉污染与高灵敏度之间的矛盾得到了解决，有助于检测目标序列。为了满足现场检测的需求，我们组装了一种侧向流动装置（LFD），作为一种快速方便的可视化结果解读策略，忽略了开放容器引起的气溶胶扩散问题。该方法的优异性能使其成为DNA甲基化分析的有希望的候选方法。

部分摘要

寡核苷酸

在这项研究中，选择miR-34a作为模型基因进行演示，该基因在肿瘤细胞中保持高甲基化状态，在正常细胞中保持低甲基化状态[14]。选择位于启动子区域的CpG位点作为DNA甲基化检测的目标。设计了六种引物（FIP、BIP、LF、LB、F3和B3）进行LAMP，以识别甲基化的CpG。FIP和BIP的5’末端分别用生物素和地高辛标记，以便通过LFD检测扩增子。

DNA甲基化分析中的交叉污染消除设计

DNA甲基化分析需要核酸扩增来提供高灵敏度和特异性，但交叉污染会与核酸扩增的灵敏度产生冲突。灵敏度越高，污染越严重。基于亚硫酸盐转化的方法根据序列差异识别DNA甲基化，而亚硫酸盐转化后的DNA是序列区分的载体。由于胞嘧啶会被脱氨基转化为

结论

DNA甲基化是癌症诊断的有希望的生物标志物。尽管基于亚硫酸盐转化的方法是DNA甲基化分析的最权威方法，LAMP在亚硫酸盐修饰后也具有高灵敏度和特异性，但由于使用含尿嘧啶的DNA作为扩增模板时无法消除交叉污染，因此气溶胶造成的假阳性结果严重影响了诊断的准确性。

CRediT作者贡献声明

刘晓楠：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，资源获取，方法学，研究设计，资金筹集，数据管理，概念构建。贾娟：方法学，研究设计。严江伟：监督，资源获取，方法学，研究设计，资金筹集，概念构建。胡文静：方法学，研究设计，数据管理。周慧云：方法学，研究设计，数据管理。张嘉兴：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：82030058）和山西省自然科学基金（编号：202203021212378）的支持。