《Analytica Chimica Acta》：Sensitivity-Improved Nanozyme LFIA with Optimized Fluid Control on Centrifugal Microfluidic Platform
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本研究开发了一种双模式气动虹吸阀（DPSV）驱动的离心微流控平台，用于提升纳米酶基快速检测（LFIA）灵敏度。通过离心加速度调控流体动力学，优化样本加载和显色底物反应过程，结合无表面修饰的气动阀实现自动化的多步骤检测，显著降低检测限并提高POC诊断的稳定性和通量。
雷王|周佳曦|陈浩|张汉星|刘凌轩|张露露|邱先波|高立增|苗贵军
北京化工大学信息科学与技术学院生物医学工程微流控芯片开发研究所，北京100029，中国
摘要
由于手动操作的不灵活性，基于纳米酶的侧向流动免疫测定（LFIA）的灵敏度可能受到不可控的色谱过程、样品或试剂利用不足以及结合效率不佳的限制。在这里，我们提出了一种离心微流控平台，通过多种策略提高了纳米酶LFIA的灵敏度，不仅实现了整个检测过程的自动化，还使每个步骤的反应更加彻底。开发了两种不同的无亲水处理的气动虹吸阀，分别基于两种不同的减速条件，以促进样品和显色底物的均匀混合和可控排放。在第一步中，实现了持续、平稳且缓慢的样品输送到检测条上，从而能够在不牺牲色谱一致性的前提下控制样品加载量。在第二步中，通过保持芯片在色谱过程中的离心状态来减缓侧向流动速度，从而增加显色底物的反应时间，提高反应效率。此外，进一步优化了芯片设计，减少了样品或试剂在芯片内部的意外损失。对所开发系统的性能进行了系统评估，基于全面的优化实现了检测灵敏度的提升，这有利于即时诊断（POC）的应用。
引言
侧向流动免疫测定（LFIA）因其简单性、快速响应和低成本而被广泛用于临床诊断，特别适合于即时诊断（POC）测试中的病毒感染快速筛查[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。相比之下，聚合酶链反应（PCR）技术虽然具有高灵敏度和特异性，但通常需要昂贵的仪器[7]、[8]、复杂的操作[9]和受过培训的人员[10]，这限制了其在资源和条件有限的场景中的应用。
众所周知，LFIA具有优异的便携性，然而传统的LFIA主要依赖于标记物的积累来产生信号，导致对低丰度目标物和早期病毒感染的检测灵敏度有限[11]、[12]、[13]。将具有酶模拟催化活性的纳米酶整合到LFIA中，通过连续的底物催化显著提高了分析灵敏度[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。尽管如此，大多数基于纳米酶的LFIA仍然依赖于手动操作，包括样品处理和试剂添加，这引入了操作者依赖的变异性，并限制了检测的标准化和高通量实现[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。为了解决这些限制，迫切需要能够精确控制基于纳米酶的LFIA中的流体处理和反应过程的便携式自动化平台[26]、[27]。离心微流控技术通过旋转控制实现无外部泵的液体操作，为将基于纳米酶的LFIA整合到稳健且自动化的POC诊断系统中提供了有希望的解决方案。
离心微流控平台利用旋转运动产生的离心力来操控流体，结合片上阀门结构，可以实现程序化的样品转移、混合、分离、反应和检测[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]。这种无泵操作显著降低了系统的复杂性、成本和对熟练操作者的依赖性。随着离心微流控技术的快速发展，越来越多的研究致力于将侧向流动条（LFS）整合到离心平台上，如表1所示。离心力显著改变了条上的色谱行为，有效克服了传统毛细驱动流动的固有局限性[35]、[36]、[37]。例如，Edward和Hemmings等人利用离心力加速了纸色谱法，从而提高了分析物的分离效率[38]、[39]。同样，Kainz等人利用离心驱动实现了高速样品迁移，在30秒内完成了白细胞介素-6的检测，检测限（LOD）低至78.3 pg/mL[40]。此外，离心力还可以调节甚至抵消毛细作用[41]、[42]、[43]。基于这一原理，Chen等人开发了一种通过流量调节实现高灵敏度检测的离心侧向流动检测平台[44]。Song等人提出了一种两阶段离心策略，显著提高了信号强度，同时保持了快速检测，将人绒毛膜促性腺激素（hCG）和血红蛋白（Hb）的LOD分别降低了64%和51%[45]。除了流量控制外，离心微流控芯片还提供了稳健的系统集成，为自动化LFIA提供了关键基础[46]。片上阀门系统是实现这种自动化的关键技术点。Zhou等人首次使用穿刺阀在离心芯片上实现了结核病标志物的自动化分析[47]。Shen等人构建了一个由柱状阀控制的集成离心LFIA平台，能够在15分钟内检测血液样本中的前列腺特异性抗原（PSA），LOD为0.028 ng/mL[48]。Wang等人通过打开或关闭通风口来控制内部空气压力，实现了CYFRA 21-1的高灵敏度检测[49]。在我们之前的工作中，我们还开发了一个利用串联虹吸阀和可溶解膜阀的集成离心LFIA平台，实现了自动化操作和数字读数[50]、[51]。尽管取得了这些重要进展，但这些流体控制阀通常涉及复杂的结构设计、表面修饰或辅助控制模块。这些要求不仅增加了芯片制造和操作的复杂性，还可能影响系统的长期存储稳定性和可靠性。因此，开发一种结构简单、操作稳定且无需辅助处理的流体调节策略对于离心LFIA平台的实际应用至关重要。
气动虹吸阀（PSVs）的发展为解决上述挑战提供了有希望的途径。这一架构最初由Gorkin等人提出，用于在离心微流控系统中实现向心泵送[52]。随后，Zehnle等人通过引入气动和排气室进一步改进了这项技术。利用气体压缩和负压效应，他们开发了多种PSVs，实现了更灵活的流体控制[53]、[54]、[55]。此外，Schwemmer等人扩展了PSVs在多通道液体并行分配和精确计量方面的应用[56]。近年来，PSVs越来越多地应用于复杂的样品处理，如血浆或外周血单核细胞（PBMCs）的分离[57]、[58]。由于其固有的优势——特别是消除了表面修饰和不需要辅助控制模块——PSVs在简化芯片架构和提高整体系统稳定性方面显示出巨大潜力。
基于上述背景，我们提出了一种基于双模式气动虹吸阀的纳米酶LFIA离心微流控芯片（DPSVs-CMF-LFIA）平台。该平台旨在建立一种新的POC检测策略，结合了结构简洁性、精确的流体控制和高的检测灵敏度。利用DPSV，该平台实现了流体控制单元的功能解耦，确保多步骤反应过程可以在单个芯片内以编程和顺序的方式执行。DPSVs消除了对表面修饰或复杂阀门结构的需求，从而确保了流体控制的长期可靠性。同时，利用阀门激活过程中产生的可控压力波动增强了片上试剂的混合，为提高检测灵敏度提供了坚实的基础。在检测策略方面，通过连续加载实现了样品体积的灵活调节，显著增强了目标物的富集能力。此外，通过将径向排列的LFS与片上屏障结构相结合，精确调节了显色底物在检测区域内的分布。这种对底物在T线和C线处停留行为的优化最大化了纳米酶系统的信号转换效率。通过这些集成设计特点，纳米酶LFIA的每个关键反应阶段都被无缝整合到离心平台中，实现了完全自动化的“样品输入，结果输出”工作流程。这项工作旨在为构建高灵敏度和集成化的离心纳米酶-LFIA系统提供新的技术见解，同时扩展其在实际POC应用中的潜力。
章节片段
离心微流控芯片系统
本研究中使用的所有试剂，包括Ru纳米酶、H1N1病毒蛋白样本（10 ng/mL）、运行缓冲液、DAB底物溶液、H2O2溶液、DAB缓冲液和基于纳米酶的LFIA条，均由中国科学院生物物理研究所提供。离心微流控芯片由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、双面胶带（300LSE，3M）和聚碳酸酯（PC）制成。离心微流控系统使用了从
离心微流控芯片上的流体操作原理
DPSV-CMF-LFIA上的所有流体操作都是通过可编程的离心电机执行的。完整的旋转控制协议如图3A所示，其中预编程的序列能够精确调节试剂转移、混合、顺序释放和色谱迁移。虽然这些操作参数在理想条件下可以理论估算或模拟，但实际上应用中往往涉及各种非理想因素和环境因素。
结论与展望
在这项研究中，我们开发了一种DPSV-CMF-LFIA，集成了自动化样品加载、试剂混合、顺序释放和信号检测。通过引入可以在不同减速率下触发的双模式气动虹吸阀，该芯片实现了稳定可靠的流体控制，无需表面亲水处理，显著简化了其结构设计和制造过程。特别是，系统研究了不同的策略以
CRediT作者贡献声明
邱先波：撰写 – 审稿与编辑、方法学、资金获取、概念化。张露露：撰写 – 审稿与编辑、方法学。陈浩：资源获取、调查、数据管理。周佳曦：监督、方法学。刘凌轩：可视化、软件。张汉星：软件、调查。苗贵军：撰写 – 审稿与编辑、方法学、形式分析、概念化。雷王：撰写 – 原始草稿、可视化、验证、方法学、调查、数据
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作部分得到了国家关键研发计划（编号：2024YFC2419100，子项目编号：2024YFC2419104）、中国河南省医学科学院中原纳米酶实验室（编号：H20240559）以及国家自然科学基金（编号：81871505、61971026）的支持。
