马兜铃酸I在药用活性炭上的吸附：分析检测、去除效果及方法环保性的评估 Maria-Alexandra Pricop, Camelia Oprean, Alexandra Teodora Lukinich-Gruia, Alexandra Ivan, Virgil P?unescu, C?lin Adrian Tatu

《Processes》：Aristolochic Acid I Adsorption onto Medicinally Activated Carbon: Assessment of Analytical Detection, Removal, and Method Greenness Maria-Alexandra Pricop, Camelia Oprean, Alexandra Teodora Lukinich-Gruia, Alexandra Ivan, Virgil P?unescu and C?lin Adrian Tatu

　　摘要
(1) 背景：马兜铃属（Aristolochia spp.）植物分布于世界各地，由于其含有有毒化合物，因此在药用方面需谨慎使用。由于含有主要致癌物质马兜铃酸I（AAI），这些植物制剂可能导致急性和慢性肾病，进而与癌症相关。这些化合物还会污染马兜铃属植物生长的环境，导致人群间接暴露于其中。
(2) 方法：本研究提供了一种使用活性炭（AC）来减少AAI毒性的实用解决方案。采用超高效液相色谱法（UHPLC）结合二极管阵列检测器（DAD）在不同时间点对AAI进行定性和定量分析。同时，还使用AGREE方法评估了色谱分析的环保性。
(3) 结果：250毫克活性炭的药片在30分钟内从甲醇溶液中去除了125微克/毫升的AAI，去除效率为97.65%。分析过程中的环保性评分为58%。
(4) 结论：本研究首次提供了一种低成本的药物和环境解决方案，用于应对AAI污染问题。UHPLC–DAD方法似乎是一种适用于AAI常规分析的环境友好型技术。活性炭表现出高效的去除效果，既可用于马兜铃属植物的药用制剂，也可用于环境净化。

1. 引言
全球对改善健康和生活质量的关注日益增加，据世界卫生组织（WHO）报告，近80%的世界人口使用天然药物[1]。传统草药的安全性常被忽视，但由于它们可能含有有毒化合物，与其他器官相比，这些药物会更容易损害肾脏[2]。其中有害化合物包括马兜铃酸（AAs）和硝基菲羧酸，这些物质天然存在于马兜铃科（Aristolochiaceae）植物中[3,4,5]。马兜铃科植物包含超过500个物种，自古以来就被用作具有镇痛和抗炎作用的传统草药[2,3,6,7,8]。尽管马兜铃酸及其衍生物的肾毒性已被持续记录[7,9]，并且这些植物的使用已被禁止[4]，但它们仍被用于多种植物疗法中[2,10,11]。1991年，比利时发生了一起重大事件：数百名女性在服用含有AAI的减肥药后出现了进行性终末期肾衰竭和尿路上皮癌，由此描述了一种新的肾脏疾病——中国草药肾病（CHN）[2,10,12]。其他报告也记录了与AAI及其衍生物暴露相关的肾损伤[10,13]和肝损伤[13,14]。所有这些综合征和病理情况都属于马兜铃酸肾病（AAN）[7]，这一医学术语正在逐渐取代CHN。易感人群不仅通过受AAI污染的药品直接暴露，AAI还可能作为生物污染物在环境中积累，并通过食物链间接进入人体[16]。AAI可在土壤中生物累积，并被栽培植物吸收，这种暴露途径很可能导致巴尔干地方性肾病（BEN），这是一种在巴尔干国家多瑙河支流沿岸农村地区出现的慢性肾病[16,17,18,19]。最常见且研究最多的AAI是马兜铃酸I（AAI），它具有高度的肾毒性和致癌性[7,20,21]，因此必须大幅减少这种毒素的暴露以降低AAN和BEN的发病率。为此，人们开发了从受污染的草药中去除AAI的方法，并通过食物链减少其暴露[4,17,22]。科学文献描述了从各种样品（如植物）中去除AAI的实验，这些样品中天然存在或被AAI污染（如药品、环境和生物样品）[22,23,24,25,26,27]，采用基于选择性吸附的多孔材料（如改性碳纳米管和微线圈）[23,27]。去除实验后，需要通过色谱方法确定样品中是否仍含有AAI。文献指出HPLC是一种常规、常见且廉价的检测方法[28]，可用于检测不同马兜铃属植物产品[29,30,31]、药用植物[32,33]以及某些含AAI的减肥产品[4,22,34,35]中的AAI，也可用于检测其在不同类型有机吸附剂中的去除/吸附情况[22]。在验证方案中使用分析方法涉及多个步骤，需要从实验室和环境安全的角度量化分析技术中使用的化学物质[36]。可以使用国际公认的评估工具（包括AGREE）来评估分析方法的环保性和实用性[37]。所得指标提供了全面证据，证明所提出的分析方法在环境上负责任，适合常规实验室应用，并且对于毒素监测具有稳健性和可持续性[38]。本研究延续了我们研究小组之前关于活性炭吸附AAI的研究[39]。通过动力学、热力学和平衡分析验证了AAI的吸附机制。此外，本研究首次探讨了在药用活性炭（AC）存在下去除AAI的效果。与之前使用的UV-VIS光谱法[39]相比，采用UHPLC–DAD系统对剩余的活性炭处理溶液中的AAI进行了定量分析。使用活性炭作为吸附剂旨在解决解毒和净化两个问题。吸附剂和色谱方法对环境友好，易于应用于环境净化和医疗解毒，为未来的研究提供了基础。

2. 材料与方法
2.1. 化学品和试剂
Sigma-Aldrich（德国汉堡）提供了纯度为97%的AAI（图1）。活性炭（AC）（Carbune Medicinal Sanvero Healthcare，罗马尼亚布加勒斯特）购自罗马尼亚蒂米索阿拉的一家当地药店。所有用于液相色谱分析的溶剂（水、甲醇、乙腈）均为HPLC级，购自Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特Merck集团）。100%冰醋酸为分析纯度，同样购自Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特Merck集团）。
图1. 马兜铃酸I的结构。
2.2. AAI标准溶液的制备
通过将5毫克标准化合物（Sigma-Aldrich，德国达姆施塔特Merck集团）溶解在20毫升HPLC级甲醇中，制备了0.250毫克/毫升的AAI标准溶液。通过连续稀释甲醇，制备了一系列工作标准溶液，浓度范围为3.90至125微克/毫升，用于校准曲线。所有溶液均储存在4°C下，以防止分析前降解并保持溶液稳定性[40]。
2.3. 样品制备
为了有效去除AAI，我们在之前的研究[39]中确定了所需的最低活性炭用量，并系统评估了吸附条件和吸附剂剂量。因此，在本研究中使用了250毫克活性炭（AC），相当于市场上常见药片中的用量，以更真实地反映实际使用情况。使用分析天平（WAS220/X，RADWAG，2005）称量含有250毫克活性炭的样品。通过将250毫克活性炭与10毫升含有125微克/毫升AAI的甲醇溶液混合来进行去除。样品基质为加入活性炭的甲醇溶液，空白样品为纯甲醇。样品在室温（21–22°C）下使用旋转混合器以18转/分钟的速度连续混合两小时，然后在预定义的时间点（0、5、10、15、20、30、45、60和120分钟）收集。所有样品均通过0.45微米MILLEX-HV SLH033NB聚偏二氟乙烯（PVDF）膜过滤器过滤，并储存在4°C下，以防止AAI降解并保持溶液稳定性。过滤后的溶液使用UHPLC–DAD进行分析，以定量残留的AAI浓度。
2.4. 色谱设备和条件
使用Dionex UltiMate 3000系统（Thermo Scientific，德国不来梅）进行超高效液相色谱（UHPLC）检测AAI。该系统由泵和带有10微升注射环的自动进样器组成。分析过程中观察到的压力波动（55–65巴）是由于施加的梯度较陡，导致流动相成分和粘度快速变化所致。流动相组成为含2%醋酸的乙腈（ACN，pH约3.4）。色谱分离在梯度洗脱程序下进行（表1），起始时流动相为60% ACN，15分钟结束时流量恒定为0.1毫升/分钟，逐渐增加至100% ACN。在AAI保留时间处，流动相组成调整为70.1–70.3% ACN和29.9–29.7%水-2%醋酸溶液。分析开始前包含一分钟平衡步骤，以使系统在流动相组成和背压方面稳定，然后注入下一个样品。
表1. 流动相组成。样品通过非极性RP-C18 Varian Polaris 5柱（Agilent Technologies，美国圣克拉拉，长度50毫米，内径2毫米，粒径5.0微米，孔径180埃）进行分离，柱温保持在25°C。使用二极管阵列检测器（DAD）记录200至400纳米范围内的光谱，272纳米处的强峰被积分（Bruker Compass 1.5 DataAnalysis软件版本4.1，Bruker Daltonik GmbH，德国不来梅）。数据采集、峰积分和仪器控制使用Chromeleon版本7.2软件（ThermoFisher Scientific，德国不来梅）完成。
2.5. 方法验证
本文采用的方法改编自Chang等人（2002）[33]和Trujillo等人（2006）[40]的研究。因此，我们小组之前用于AAI HPLC分析的一些色谱参数进行了调整，以适应当前使用的基质（活性炭），以及其他用于分析马兜铃属植物和产品的HPLC-DAD方法[29,30,31,41,42]。同时遵循ICH指南[43]。在本文中，将活性炭粉末加入含有125微克/毫升马兜铃酸I的甲醇溶液中。
2.5.1. 线性
为了构建校准曲线，使用六种不同浓度的甲醇稀释液（3.9微克/毫升至125微克/毫升）。通过绘制标准溶液稀释液的AAI峰面积与AAI浓度之间的关系来生成校准曲线。
2.5.2. 检出限（LOD）和定量限（LOQ）
通过连续稀释AAI在甲醇中的浓度，直到UHPLC–DAD系统获得信噪比为3:1和10:1，分别确定了检出限（LOD）和定量限（LOQ）。LOD和LOQ基于响应的标准偏差（SD）和校准曲线的斜率计算得出，具体公式如下。灵敏度通过回归方程的斜率评估。LOD = 3.3 × S/SD，LOQ = 10 × S/SD
2.5.3. 特异性
通过比较AAI标准溶液、空白样品和含基质样品的色谱图来评估方法的特异性。
2.5.4. 准确度、精密度和回收率
为了确定精密度、准确度和回收率，使用了三种浓度水平（125.00微克/毫升、15.63微克/毫升和7.81微克/毫升）的标准校准溶液，每种浓度进行九次测定。结果以标准偏差（SD）表示日内精密度，以相对标准偏差（%RSD）表示准确度，以相对误差（E，%）表示回收率。回收率通过测量浓度与理论浓度之比计算，结果以%RSD表示。
2.6. 去除效率
活性炭的去除效率（R%）使用以下公式计算：
R% = (C0 ? Cf) / C0 × 100，
其中C0为样品基质中AAI的初始浓度（毫克/升），Cf为样品基质中残留的AAI浓度（毫克/升）。
2.7. AGREE分析环保性
使用Analytical GREEnness计算器（v.0.5.2020）[44]评估色谱方法的环保性，该方法提供简单且信息丰富的结果。绿色分析化学的12项原则被转化为一个统一的0-1评分标准，最终得分是根据这些原则计算得出的。一个象形图表示最终得分、分析程序在每个标准中的表现以及用户分配的权重。在象形图的中间显示了总分，颜色越接近深绿色，表示程序越环保，因此得分也越高，接近1分。为了使该方法适用，必须对分析程序进行验证，例如检测限（LOD）、精度、准确性和线性等指标，这些指标需要达到可接受的水平。

2.8 统计分析
所有AAI和AC样品的标准稀释液都在相同的条件下进行注射。统计分析使用的是Microsoft? Excel? for Microsoft 365 MSO（版本2502，构建16.0.18526.20168）32位（微软公司，美国华盛顿州雷德蒙德）软件包中的数据分析工具。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行t检验。

3. 结果
一种常见的AAI分析、检测和定量方法是使用非极性（C18）反相（RP）柱子，流动相由酸化水与甲醇或乙腈以等度或梯度模式混合而成，并配备紫外（UV）或光电二极管阵列（DAD）检测器[22,32,33,40,45]。本研究首次探讨了活性炭片剂对溶解在甲醇溶液中的AAI的去除效果。由于本文提供了UHPLC验证方案，因此校准曲线中的起始浓度设为125 μg/mL，该浓度在272 nm处产生最高强度。甲醇广泛用于从植物或生物材料中提取AAI[29,30,33,40]、基于马兜铃属（Aristolochia）的药品[34,40,41]以及使用不同类型吸附剂的AAI去除实验[46,47]，因此选择甲醇作为溶剂用于溶解和稀释。此外，在某些使用合成材料去除AAI的实验中 also 使用了甲醇[46,47,48]。选择这些时间点来量化AAI的去除速率，以最佳地记录毒素被活性炭去除的速度及其何时降至检测限以下。去除AAI后的后续浓度也被纳入校准曲线中，以评估活性炭的提取效率。文献中的一些数据描述了通过液相色谱法进行AAI的提取和分析，这些数据构成了我们当前研究的起点[29,30,31,34,40,49]。
我们的实验室之前已经通过修改文献中的一些方法[40]，对RP-HPLC方法在环境样品中分析AAI进行了验证[18]。RP-HPLC方法还被用来检测活性炭吸附的一些药物[50]。此外，本研究还验证了该方法在活性炭存在的情况下分析AAI的适用性。通过线性回归方程、线性范围和AAI回收率来评估该方法在浓度范围内的可靠定性和定量分析能力。
发现AAI标准品和样品基质中AAI的保留时间分别为3.77 ± 0.07分钟和3.87 ± 0.11分钟。AAI在AC样品中的保留时间（分钟）和紫外吸收光谱（图2-红线）与参考标准品（图2-蓝线）相匹配；同时，在相同条件下也注射了AC基质在甲醇中的对照（灰线）和甲醇溶剂空白（绿线）。
图2. 色谱重叠图：AAI标准溶液（125 μg/mL）（蓝线）；样品基质（250 mg AC溶于10 mL 125 μg/mL AAI标准溶液中）5分钟后（橙线）；AC在甲醇中（灰线）；甲醇溶剂空白（绿线）。在保留时间<3分钟时观察到重复的色谱伪峰。与甲醇空白和提取对照实验的比较表明，该峰来源于甲醇提取过程中释放的可溶性微量物质（例如增塑剂）。这一峰在所有提取样品中都一致出现，并未影响AAI的量，且与目标化合物分离明显。该峰在不同注射体积下保持稳定，表明它是提取过程中的系统伪峰而非样品降解所致。

3.1 检测限（LOQ）、定量限（LOD）和灵敏度
定量限（LOQ）支持线性范围低至2.5770 μg/mL，检测限（LOD）评估为0.8504 μg/mL，进一步证明了该方法适用于痕量浓度分析。陡峭的斜率（吸光度（mAu）/μg/mL）表明该方法对浓度变化的响应强烈，反映了其在低浓度下也能检测和定量AAI的能力。随后对标准物质的低浓度进行了灵敏度验证，并确定了AAI的LOD和LOQ。

3.2 线性
校准曲线表现出极好的线性，回归方程为y = 13,651,528.8281x + 16,848.4379，相关系数（R2）为0.9998，证实了峰面积（y）与分析物浓度（x）之间的强线性关系。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）对回归模型进行了统计分析，p值1.92 × 10?8 < 0.0001，验证了回归曲线的统计显著性。此外，t检验（吸光度（mAu）/μg/mL）的结果表明斜率显著不为零（t = 132.99，p < 0.0001），进一步支持了线性模型用于定量分析的有效性。总之，这些结果证明了该方法在测试浓度范围内的强线性和统计稳健性。

3.3 准确度、精度和回收率
在三个AAI浓度水平（125.00 μg/mL、15.63 μg/mL和7.81 μg/mL）下，分别测量了九次精度和准确度。日内结果显示了该方法的良好精度，所有浓度水平的相对标准偏差（%RSD）均低于5%（表2）。
表2. UHPLC–DAD方法的精度（n = 9/组）。
所有三种AAI分析浓度的准确度（以相对误差%表示）均低于5%（表2）。最高浓度（125 μg/mL）的相对误差在?1.17%到+1.46%之间，15.63 μg/mL的相对误差在?2.80%到+4.64%之间，7.81 μg/mL的相对误差在?4.77%到+3.47%之间（表2）。在三个AAI浓度水平下，计算了平均回收率（%）、标准偏差（SD）和%RSD（表3）。最高浓度的平均回收率和%RSD分别为100.285%和0.878%，证实了该方法具有出色的准确度和精度。15.63 μg/mL和7.81 μg/mL浓度的%RSD分别为2.343%和3.154%，平均回收率分别为99.426%和97.243%。
分析精度、准确度和回收率的数据表明，该方法适用于定量分析。

3.4 关于分析程序性能的AGREE报告
该程序包含AAI溶液和AC粉末的混合物——所有操作都在少量样品制备步骤中完成，随后进行UHPLC–DAD分析。色谱分析是自动化的，分析的样品量小，且产生的废物少。尽管能耗相对较高，但UHPLC–DAD分析常用于这类样品的分析。不幸的是，提取和色谱分析中使用的溶剂是非生物来源的，因此对环境有毒。该方法的得分为0.58，缺点是使用了高度易燃和有毒的溶剂（图4）。

4. 讨论
本文首次表明，按照生产商（Carbune Medicinal Sanvero Healthcare，罗马尼亚）的说明，推荐用于疑似中毒情况下的基本治疗的药用量活性炭可以在30分钟内去除125 μg/mL的AAI浓度。文献中描述了类似的HPLC–UV方法用于AAI的分析[30,34,40,41]。所提出的UHPLC–DAD方法在样品制备的简便性方面优于这些方法，也优于我们团队之前使用的UV-VIS分光光度法来检测活性炭对AAI的吸附[39]。我们新开发的UHPLC–DAD方法在分析时间和灵敏度方面都有优势。与其他文献中介绍的方法相比，当前UHPLC–DAD条件的选择性显著降低了AC基质的影响，使其适用于分析甲醇样品中的AAI和AC混合物。与UV检测器相比，DAD的优势在于可以在多个波长（200至400 nm之间）同时进行分析，这种灵活性使我们能够选择最适合的波长，从而获得最佳的峰分离和峰强度。因此选择了272 nm的波长，因为它实现了更短的HPLC分析时间，并且色谱峰更清晰、半高宽（FWHM）更小。在之前的研究中，最佳波长分别为390 nm[16,18]、320 nm（通过UV-VIS分光光度法检测）[39]或319 nm（通过UV-VIS HPLC检测器检测）[23]。此外，需要注意的是，本研究使用了不同的HPLC系统，这也影响了最佳检测波长。这些差异可能是由于基质依赖性或不同的HPLC条件造成的。那些研究中的分析时间超过15分钟[29,35,41,45]，而本文描述的UHPLC–DAD方法在5分钟内即可检测到AAI。UHPLC系统的快速检测得益于较短的柱长和由乙腈和酸化水组成的流动相；这种组合比使用不同比例的甲醇和水的组合更有效[29,34,40,42]。文献中还使用类似的HPLC方法测定了不同吸附剂对AAI的去除效果；去除过程在不同的中药处方[33]、马兜铃属（Aristolochia）叶子[35]、马兜铃属植物及其药片[40]、智利马兜铃（Aristolochia chilensis）提取物[42,45]中得到了验证。有几项研究表明，吸附剂可以在30分钟内去除AAI，并且其检测限（LOD）约为0.03微克/毫升[24,51,52]。由于AAI的毒性，含有AAI的药物和传统制剂的临床和医药应用受到限制，甚至在许多国家被禁止[53]。因此，必须仔细设计一种合适的去除AAI的方法，因为AAI是毒性最强的化合物，在马兜铃属植物中的浓度最高[21]。研究人员已经进行了大量研究以降低含有AAI的传统草药疗法的毒性[22,55,56]。目前的去除方法包括微生物方法[57]、物理吸附分离[46]和化学方法[58]。选择吸附分离方法是因为它们能够特异性地中和AAI引起的毒性，并且吸附材料和其他组分的有效性也很高[22]。报道的AAI分离和富集方法包括固相萃取（SPE）、电膜萃取（EME）、快速、简便、廉价、有效、耐用且安全的方法（QuEChERS）以及超临界流体萃取（SFE）[23,25,26,54]。在中毒情况下，最常用的材料之一是活性炭（AC）。由于其能够中和或消除有害物质的毒性[59]，活性炭在过去一个世纪中被用于胃部去污，并且至今仍在临床环境中广泛使用[60]。与活性炭结合的有毒物质的数量取决于活性炭与物质的比率[39,59]。在意外或故意摄入马兜铃属植物产品后，活性炭可以外用于（例如茶制剂）或内用于（例如医疗治疗）以去除AAI[59]。活性炭的高去除效率可以通过在优化条件下吸附剂-吸附质界面发生的吸附过程来解释，该过程遵循伪二级动力学，并符合Sips等温线模型，表明AAI与活性炭之间有很强的亲和力。这一过程的自发性和吸热性质进一步支持了活性炭作为AAI去除剂的有效性[39]。考虑到活性炭对马兜铃属植物制剂中AAI去除的效果，在接触后30分钟内，甲醇溶液中的去除效果有所改善。

4.1 分析方法的绿色度评估及适用性
为了证明该方法符合绿色分析化学（GAC）的原则及其适用于常规分析应用，我们使用AGREE[37]对其绿色度进行了评估。如图4所示，AGREE通常报告验证方法对绿色分析化学（GAC）12项原则的遵守情况，因此整个分析方案都得到了评估。AGREE提供了一个一致的评分；对于AGREE，将值视为100，则得分为58。这一评分表明各种工具可以提供对方法关键方面（遵守GAC、适用性和实用性）的标准化和一致性的评估。在生物分析中，由于UHPLC–DAD的特异性和灵敏度，它目前被视为标准方法，并且这种仪器在专门的实验室中操作（离体）。只要UHPLC–DAD分析需要在离体条件下进行，并且样品体积小且易于运输，生物分析样品制备在未来也将保持离体状态。由于标准品的溶解度仅限于甲醇等危险溶剂，并且其产生的废物少于10毫升，因此标准10至12的评分将为0.58。

4.2 研究的优缺点
本研究首次提供了一种针对AAI毒性的双重解决方案。其中一个解决方案用于医疗目的，即因摄入受AAI污染的药品而导致的急性中毒。另一个解决方案用于环境去污，即针对间接暴露于受污染环境的情况。活性炭是一种常用的药物，用于缓解各种中毒情况，在甲醇溶液中添加活性炭以去除AAI。常用的、简便的、廉价的且灵敏的方法UHPLC–DAD首次被验证用于在含有活性炭的甲醇溶液中定量AAI。值得注意的是，使用相对少量的活性炭就能获得较高的去除率，表明即使低剂量也能在短时间内实现显著的去污效果。这些发现还表明，活性炭是一种低成本、广泛可用且环保的材料，适合用于修复被马兜铃酸污染的样品。然而，我们的研究也存在一些局限性，需要进一步实验来验证活性炭在体外、体内和环境中的效果。(i) 简单基质：本研究是在纯净的甲醇溶液中进行的。实际应用（例如，在复杂的草药提取物、土壤、水或胃肠道液体中）涉及其他有机化合物对活性炭结合位点的竞争。(ii) 体外/体内条件：尽管在环境影响方面结果令人鼓舞，但直接将其外推到人体解毒应用时需要谨慎。人体肠道中的活性炭与AAI的比例和接触时间会有所不同。(iii) 单一毒素：本研究仅关注AAI的去除。马兜铃属植物还含有其他有毒类似物（例如AAII、马兜铃内酰胺），这些物质尚未进行测试。需要研究这些物质的去除特异性。此外，还需要通过光谱方法、动力学、热力学、平衡、吸附和质谱等方法对活性炭材料进行进一步表征。

5. 结论
本研究首次验证了UHPLC–DAD方法用于AAI分析的有效性。此外，本研究还首次记录了通过添加药用活性炭从甲醇溶液中去除AAI的过程。实验表明，250毫克的活性炭片剂可以在30分钟内去除125微克/毫升AAI中的97.65%。绿色度评估显示分析性能得分为58%。我们的研究为类似的新实验提供了坚实的基础，并为开发或改进用于从马兜铃属植物生长并污染食物链的环境中去除或提取有毒AAI的方法提供了依据，例如在受巴尔干地方性肾病影响的国家，或在AAI普遍存在的国家使用的某些草药制剂中，甚至是在人体意外摄入后。本研究为设计低成本的分离材料提供了指导，以便快速高效地从复杂的自然系统中去除快速作用且环保的有毒物质。