《Aquaculture》：Establishment of CRISPR/Cas9-mediated gene editing and larval rearing techniques in Epinephelus fuscoguttatus
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本研究首次建立虎斑鳗鲈CRISPR/Cas9基因编辑方法，通过微注射技术编辑cyp19a1a和foxl2基因，成功获得突变个体，为解析性别决定机制和优化水产育种策略提供工具。
程芳洲|徐家庆|程新凯|李光略|崔中凯|李超伟|徐燕|胡桥木|陈松林
上海海洋大学渔业与生命科学学院，中国上海201306
摘要
本研究首次建立了用于虎斑石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）的CRISPR/Cas9基因编辑方案。我们将受精卵固定在琼脂糖模具中，并使用定制的微注射针将2–3纳克的核糖核蛋白（RNP）分别注入I–VIII细胞阶段的每个卵子中，这些RNP分别针对cyp19a1a基因和foxl2基因。为了培养基因编辑后的幼鱼，我们首先建立了在室温下孵化和精心饲养Epinephelus卵子的方法。在受精后72小时，我们检测到胚胎存活率为实验组16%，而对照组为90%。此外，在受精后4天（dpf）检测到注射幼鱼的突变。在cyp19a1a基因和foxl2基因中观察到了两种类型的突变，突变效率分别为15%。我们还在受精后60天（dpf）通过鳍剪片检测到了基因编辑幼鱼的突变，发现53个个体中有5个个体的cyp19a1a基因发生了三种不同的突变类型。直到120天，实验组仍有53个个体存活，存活率为10%，而对照组约为24%。该方案为解析虎斑石斑鱼的性别决定机制和开发优化繁殖策略提供了有力工具。
引言
基因编辑能够精确修改选定的基因组位点，从而改变DNA序列，进而改变遗传信息和表型特征（Cong等人，2013；Esvelt和Wang，2013）。与传统繁殖方法相比，新型的基因编辑技术可以在特定基因组位点诱导目标突变，从而精确修改具有经济价值的特征，并生成改良的种质资源，其准确性和开发时间大大缩短（Gratacap等人，2019；Lu等人，2021），并在淡水鱼类研究中取得了最新突破（Yang等人，2022）。然而，对于海洋鱼类来说，尚未广泛建立高效可靠的基因编辑工作流程。一个关键的技术障碍是许多海洋物种产生的受精卵是浮游性的，难以固定以便进行微注射。这些卵（直径约1毫米）通常具有厚实的弹性卵膜，这使得针头穿透变得复杂，并增加了微注射过程中的机械损伤风险（Goto等人，2019）。
CRISPR/Cas9基因编辑技术利用单导向RNA（sgRNA）与其DNA靶标之间的沃森-克里克碱基配对来指导Cas9切割，创建位点特异性的双链断裂，自2010年代初被广泛采用以来，它迅速成为主要的反向遗传学工具（Jinek等人，2012；Sternberg和Doudna，2015；Wang等人，2016；Zhang，2019）。与TALENs等传统基因编辑技术相结合，这项技术在鱼类性别决定研究中取得了重大进展。在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中，靶向破坏amhy（Li等人，2015）、gsdf（Neng等人，2022）和dmrt1（Li等人，2013）等位点，实现了XY个体的完全或部分性别反转；而在XX个体中，靶向破坏foxl2（Zhang等人，2017）、cyp19a1a（Zhang等人，2017）和cyp17a1（Yang等人，2021）等位点，也实现了完全或部分性别反转，证明了这些基因在性别分化中的关键作用。在普通鲤鱼（Cyprinus carpio）中敲除cyp17a1产生了全雄性群体；将XX雄性与野生型雌性杂交产生了全雌性后代，展示了鲤科鱼类中性别比例的遗传控制（Zhai等人，2022）。在Carassius gibelio中，破坏foxl2同源基因诱导了F0代鱼类的性别反转或不育（Gan等人，2021），而失去gsdf同源基因则在后代中产生了性别反转的雄性（Wang等人，2022）。在海洋物种中，使用TALEN介导的方法敲除dmrt1在中国舌鳎（Cynoglossus semilaevis）中产生了生长速度显著增加的基因编辑雄性，其体重可与野生型雌性相当（Cui等人，2017）。鉴于CRISPR更广泛的靶向范围、更高的效率、更低的成本以及相对于早期核酸酶的易用性，它已成为鱼类靶向突变、功能基因组学和分子育种不可或缺的工具（Ahmed和Shikai，2024；Zhu等人，2024）。
虎斑石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）是一种具有高蛋白质含量和市场需求的重要的石斑鱼物种（Rimmer和Glamuzina，2019）。在中国南部，石斑鱼养殖业迅速发展，但Epinephelinae亚科中的原雌性雌雄同体现象（雌性向雄性性别反转）使得亲鱼管理变得复杂：生殖腺通常首先分化为功能性卵巢，在内源性或环境信号的诱导下，卵巢会退化，同时睾丸开始发育，这一过程可能需要几个月的时间（Shuisheng等人，2023）。由此导致的成熟雄性亲鱼短缺限制了种子的生产。常用激素诱导的性别反转来生产单性群体（Huang等人，2018；Miyoshi等人，2025），但这带来了环境和食品安全问题（Mlalila等人，2015）。因此，标记辅助选择和基因组编辑方法是生成单性幼鱼的可行替代方案。然而，由于缺乏高效的基因编辑方法，石斑鱼的进展受到了阻碍。因此，建立可靠的基因组编辑方案对于解析性别决定途径、提高雄性比例和推进石斑鱼的性别控制育种至关重要。
cyp19a基因编码的芳香化酶在生殖腺组织中催化雌激素的生物合成，从而调节卵黄蛋白的产生和卵母细胞的生长（Conley和Hinshelwood，2001）。cyp19a1a是细胞色素P450芳香化酶的卵巢异构体。在尼罗罗非鱼中，cyp19a1a在孵化后不久即可检测到其表达（Sudhakumari等人，2005），而cyp19a的基因缺失会损害卵巢的维持和排卵功能（Zhang等人，2017）。药理学抑制芳香化酶可以在斑马鱼（Danio rerio）中诱导雌性向雄性的性别反转，并阻止黑鲷（Acanthopagrus schlegelii）和橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）的自然性别转变（Lee等人，2002；Huang等人，2018），这支持了cyp19a1a在鱼类性别决定中的保守作用。
在早期哺乳动物的卵巢发育过程中，foxl2激活细胞色素P450芳香化酶的转录，促进雌激素的生物合成并驱动生殖腺的卵巢分化（Pannetier等人，2006）。在硬骨鱼类生殖腺分化过程中cyp19a1a的转录调控中，foxl2已被确定为cyp19a1a的上游特异性调节因子（Guiguen等人，2010）。在日本比目鱼（Paralichthys olivaceus）中，一种具有温度依赖性性别决定的物种中，foxl2直接调节cyp19a1a的转录表达（Yamaguchi等人，2007）。通过使用cyp19a1a启动子区域的缺失突变体进行转染实验、电泳迁移实验（EMSA）以及双荧光素报告系统验证，证明foxl2与cyp19a1a启动子中的一个特定顺式作用元件结合，从而介导该基因的转录调控（Wang等人，2007）。在研究鱼类性别反转的过程中，发现foxl2在Epinephelus merra的性别转变末端过渡阶段表达显著下调（Alam等人，2008）。尽管foxl2的具体调控模式在不同硬骨鱼类中存在物种差异，但它被广泛认为是调控硬骨鱼类生殖腺发生和生殖腺分化的核心功能基因。
在这里，我们报告了在受精的虎斑石斑鱼卵子中成功使用CRISPR–Cas9介导的cyp19a1a和foxl2基因敲除，描述了一种针对Epinephelus fuscoguttatus的优化微注射程序，并描述了4 dpf时幼鱼的突变情况。我们进一步将53个cyp19a1a基因编辑后的幼鱼饲养到120 dpf，通过对鳍剪片样本进行Sanger测序确认了五个个体的cyp19a1a基因编辑。
部分内容
受精卵的收集
在海南兰亮生物科技有限公司和海南东方之星生物科技有限公司选择了适当年龄和健康状况良好的性成熟的虎斑石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）亲鱼。通过温和的腹部剥离方法获取成熟的卵母细胞和精子，并使用干法进行受精，然后用海水激活。在立体显微镜下选择了具有良好浮力、近似球形且内部透明无杂质的受精卵
微注射工具的创新
根据卵子的大小，选择了三种不同参数的琼脂糖凝胶板，其中宽度为0.72±0.05毫米、深度为0.80±0.05毫米的凝胶板（图1A-C）。相比之下，第二和第三种凝胶板的凹槽无法嵌入卵子（宽度：0.80±0.05毫米，深度：0.80±0.05毫米；宽度：0.68±0.05毫米，深度：0.75±0.05毫米）。
使用四组不同的参数制作微注射针后，我们发现
讨论
迄今为止，尚未有研究报道在石斑鱼中进行基因编辑。虽然大量文献证明了在淡水鱼类中成功建立了微注射技术（Wang等人，2024），但在海洋鱼类中的相关报道仍然很少，仅在某些物种中建立了此类技术，如中国舌鳎（Cui等人，2017）、橄榄比目鱼（Paralichthys olivaceus）（Wang等人，2021）和大黄鱼（Larimichthys crocea）（Li等人，2023a）。
主要挑战在于
结论
在这项研究中，我们成功建立了用于海洋养殖物种虎斑石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）的微注射技术，以及实验室条件下少量Epinephelus胚胎的孵化和培养技术。通过注射cyp19a1a基因的RNP，在60 dpf的鱼幼鱼的鳍组织中检测到了突变，并成功将幼鱼饲养到120 dpf。我们还成功地对foxl2基因进行了靶向编辑。这项工作为
作者贡献声明
程芳洲：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，方法学，研究，数据管理。徐家庆：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，验证，研究，数据管理。程新凯：撰写 – 审稿与编辑，方法学，研究。李光略：撰写 – 原始草稿，研究。崔中凯：研究。李超伟：撰写 – 审稿与编辑。徐燕：撰写 – 审稿与编辑，方法学，数据管理。胡桥木：撰写 –
伦理批准
本研究完全符合研究伦理规范。所有动物实验和方法均按照相关批准指南和规定进行，并得到了中国渔业科学院动物护理和使用委员会的批准（YSFRI-2025017）。
未引用的参考文献
Jiang等人，2022
Li等人，2023b
致谢
本工作得到了山东省重点研发计划（2025LZGC010, 2023ZLYS02, 2024CXPT071-1）、国家海洋渔业生物育种与可持续产品重点实验室（BRESG-JB202502）、青岛蓝色种子产业创新项目（QDLYY-2024012）、海南种子产业实验室（B24YQ0010, B26H1QC03）、泰山学者计划（TSQNZ20240843）和国家海洋渔业生物育种与可持续产品重点实验室的支持
