综述：细胞外囊泡与外泌体在杜氏肌营养不良治疗中的多面作用

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Transforming Duchenne muscular dystrophy therapy: The multifaceted role of extracellular vesicles and exosomes

本综述系统阐述细胞外囊泡（EVs）/外泌体（exosomes）作为多功能载体在杜氏肌营养不良（DMD）诊疗中的潜力，涵盖天然EVs的抗炎/抗纤维化作用、工程化EVs递送CRISPR/Cas9/寡核苷酸等策略，并剖析临床转化挑战（如标准化/GMP），为DMD整合疗法提供新视角。

　　

引言

杜氏肌营养不良（DMD）是一种X染色体连锁隐性遗传的严重神经肌肉疾病，由编码肌营养不良蛋白（dystrophin）的基因突变导致。肌营养不良蛋白是维持肌膜稳定性的关键骨架蛋白，其缺失会引发反复肌坏死-再生循环，最终致骨骼肌被纤维化和脂肪组织替代，伴慢性炎症、氧化应激和钙稳态紊乱，患者常因心肌病或呼吸衰竭早逝。现有疗法（糖皮质激素、外显子跳跃反义寡核苷酸、终止密码子通读剂、病毒载体基因治疗等）仅延缓病程，且存在免疫反应、脱靶效应或适用人群有限等问题，亟需更安全高效的新策略。

EVs与条件培养基组分概述

细胞分泌的细胞外囊泡（EVs）是脂质双层包裹的纳米颗粒，按国际EVs协会（ISEV）指南分为小型EVs（<200 nm）、中型/大型EVs（>200 nm）等亚型。其中，源自内体的“外泌体”（small EVs/exosomes）尺寸约30–150 nm，可携带蛋白质、脂质、代谢物及核酸，介导细胞间通讯。条件培养基则包含EVs、生长因子（GFs）、细胞因子及非编码RNA（如微小RNA/miRNA）等，是细胞无治疗的重要资源。

DMD分子病理与EVs的致病/诊断角色

DMD病理核心是肌纤维损伤→卫星细胞耗竭→纤维化，EVs在此过程中双向作用：一方面，病变肌细胞释放的EVs含促纤维化miRNA（如miR-199a-5p上调α平滑肌肌动蛋白/胶原），通过心-骨骼肌“器官对话”加重病情；另一方面，血浆EVs来源的miRNA谱变化（如miR-133a-3p上调、miR-29c-3p下调）可作为DMD诊断/监测的生物标志物，尤其CD63/MHC II阳性EVs富集miR-1/miR-133a/miR-206，与肌肉病变程度相关。

未修饰EVs/外泌体的治疗潜力

间充质干细胞（MSCs）旁分泌效应主要依赖其EVs：羊水MSCs来源EVs促进DMD肌母细胞增殖和肌肉干细胞（MuSCs）激活，局部注射至mdx小鼠后增加新生肌纤维、减少胶原沉积；胎盘MSCs来源外泌体通过传递miR-29c抑制转化生长因子-β（TGF-β）信号，降低膈肌/心脏纤维化并提升泛素性肌营养不良蛋白表达。此外，心脏球源细胞（CDCs）外泌体经心肌注射改善mdx小鼠左心室功能、运动能力，并短暂恢复多组织肌营养不良蛋白，机制与外泌体miR-148a有关。

工程化EVs/外泌体的精准策略

非肌营养不良蛋白修复方向：组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）处理DMD纤维脂肪源性祖细胞（FAPs）后，其EVs中miR-206水平升高，促进MuSCs活化并抑制纤维化——用拮抗miR（AntagomiR）敲低miR-206会削弱此效应。另研究将膜联蛋白A1（ANXA1）锚定于成肌细胞外泌体表面，联合磁性纳米管实现磁靶向递送，在mdx小鼠胫骨前肌诱导巨噬细胞向抗炎M2表型极化，增强肌力。

肌营养不良蛋白修复方向：①血清EVs封装SpCas9蛋白，成功切除mdx小鼠外显子24–25，恢复肌营养不良蛋白；②HEK293T细胞来源EVs通过FKBP-FRB化学二聚系统招募Cas9蛋白，并用病毒RNA包装信号+核酶自剪切结构引导sgRNA入EVs，在人DMD诱导多能干细胞（iPSCs）分化的肌细胞中实现超90%外显子跳跃效率，单次注射mdx小鼠获长效基因组校正；③筛选出外泌体锚定适配体（EAA），将靶向鼠DMD外显子23的磷酰二胺吗啉代寡聚物（PMO）连接至肌管来源外泌体，注射后显著提升肌细胞摄取率和肌营养不良蛋白阳性纤维比例；④封装全长肌营养不良蛋白mRNA的外泌体静脉注射mdx小鼠，在骨骼肌/心肌检测到蛋白表达，并改善握力/肌肥大。

临床转化的核心挑战

尽管EVs/外泌体具低免疫原性、天然靶向等优势，但临床转化仍面临多重瓶颈：①来源与标准化——不同细胞来源（年龄/传代次数影响功效）、分离方法（超速离心/试剂盒/微流控）导致批次差异（纯度/粒径/载量波动）；②稳定性与储存——冻融易致膜破裂，长期储存需-70℃且避免反复冻融；③药代动力学——全身注射后<5%剂量3小时仍存血，网状内皮系统快速清除限制靶组织递送（可通过水凝胶缓释改善）；④安全性——肿瘤来源EVs可能携致癌miRNA，需严格选择非致瘤细胞；⑤监管与生产——GMP级生产需统一培养体系、三步纯化流程及理化/生物学质控标准，剂量标准化（10⁹–10¹²粒子/剂）和规模化产量（10⁶细胞产1–5×10¹⁰粒子）待优化。

未来展望

EVs/外泌体有望成为DMD组合疗法的关键一环：例如装载CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）的外泌体-脂质体杂交系统可延长循环半衰期并提高肌肉靶向性；或共递送皮质类固醇与抗纤维化miRNA实现协同增效。随着工程化技术（表面配体修饰/载药优化）和标准化体系的完善，这类“天然纳米载体”或推动DMD治疗从单一缓解向多靶点治愈迈进。