通过多光谱技术、热力学分析、分子对接以及分子动力学模拟，揭示羟基酪醇与人血清白蛋白之间的分子相互作用机制

《Bioorganic Chemistry》：Unraveling the molecular interaction of hydroxytyrosol with human serum albumin via multi-spectroscopy, thermodynamic analysis, molecular docking and molecular dynamics simulation

羟基酪醇与人类血清白蛋白的分子相互作用机制研究通过多光谱分析、热力学分析、分子对接和分子动力学模拟综合探讨，发现羟基酪醇主要与白蛋白的Sudlow I位点结合，形成疏水-氢键复合物，导致白蛋白构象和二级结构改变，同时验证了静态淬灭为主的光谱机制。

　　

严雄|马继龙|曾晓成|彭伟|谭莎|王康|万一龙|周辉|夏杰|吴学文

湘潭大学化学工程学院制药工程系，中国湘潭411105

摘要

羟基酪醇（HT）是一种强效抗氧化剂，能够清除自由基并保护细胞，同时也是功能性食品中的主要活性成分之一。由于其出色的生物学和药理学作用，近年来HT的摄入量一直在增加。然而，HT与循环系统中主要蛋白质的相互作用机制尚不明确。本研究通过多光谱分析、热力学分析、分子对接和分子动力学（MD）模拟，在分子水平上分析了人血清白蛋白（HSA）与HT的结合相互作用。紫外-可见光吸收光谱、三维（3D）荧光光谱、同步荧光光谱、圆二色光谱（CD）光谱、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）以及表面疏水性实验表明，HT诱导了HSA的构象变化和轻微的二级结构变化。热力学分析和位点竞争实验显示，HT主要通过疏水性作用与HSA的Sudlow位点I结合（ΔH > 0, ΔS > 0），且这一过程是自发的（ΔG < 0）。HT对HSA的荧光淬灭机制以静态淬灭为主，同时伴有轻微的动态淬灭。分子对接结果显示，HT与HSA的Sudlow位点I的结合稳定性高于Sudlow位点III和Sudlow位点II（结合自由能分别为-25.12 kJ·mol?1）。此外，HT通过与HSA的疏水作用和氢键相互作用进行结合，这一点也得到了分子对接和MD模拟的验证。总之，本研究有助于深入理解HSA与HT的相互作用机制，以及HT的吸收、分布和转运过程。

引言

羟基酪醇（HT）是天然植物中的次级代谢产物，是一种两亲性多酚化合物，具有较高的脂溶性和水溶性，主要存在于橄榄中的橄榄苦苷（OL）中。[1] 通常，HT的主要来源是橄榄在成熟、储存和加工过程中的水解。[2] HT是一种强大的自由基清除剂，能够保护细胞。近年来，由于其优异的生物学和药用特性（包括抗动脉粥样硬化、抗癌、抗菌和抗炎作用），HT受到了食品、饲料、补充剂和制药行业的广泛关注。[3] 然而，HT的化学性质相对不稳定，其吸收和分布可能受到食物成分和胃肠道环境等因素的影响，从而导致吸收和生物利用度受限，进而影响其疗效。因此，研究HT与血清蛋白的相互作用对于理解HT的吸收、分布和转运机制至关重要。目前关于HT与主要循环系统蛋白相互作用的研究还不够充分。

人血清白蛋白（HSA）是一种天然且具有高度生物相容性的载体蛋白，约占人体循环系统中总蛋白质的60%，是含量最丰富的血清蛋白。它具有独特的三维结构以及特定的结合位点（如Sudlow位点I和II）和多种表面功能基团。这些结构特性使HSA能够转运和代谢各种物质，并推动了靶向药物递送系统的进展。[4],[5],[6],[7] 此外，HSA还能与多种药物可逆结合，表现出良好的药代动力学特性。[4],[6],[8],[9],[10],[11] 最近的研究发现，某些活性分子（如迷迭香酸[12]、柚皮素[13]和wedelolactone[14]）可通过氢键和静电相互作用自发地与HSA结合，改变HSA的二级结构并影响其活性。此外，生物大分子（如leupeptin[15]和pitolisant[16]）的存在也会诱导HSA的构象重组。研究还表明，金属复合物会改变血清白蛋白的构象及其变性途径。[17] 因此，这些研究进一步突显了HSA作为多功能递送载体的适应性。

总体而言，HSA具有生物相容性和稳定性，因此具有很大的应用潜力，可作为药物递送材料。[18],[19],[20],[21],[22] HSA也是蛋白质毒性配体结合实验中最常研究的模型蛋白。最近，为了更好地了解增塑剂[23]、除草剂[24]和污染物[25],[26]对人体的潜在毒性风险，研究人员通过多光谱分析和分子动力学（MD）模拟技术研究了这些物质与HSA的相互作用。

因此，本研究的目的是结合多光谱分析、热力学分析、分子对接和MD模拟技术，探讨HT与HSA之间的分子相互作用（图1）。同时，还进行了位点竞争实验和表面疏水性实验，以揭示它们相互作用的特征。

材料与试剂

HT（98%，批次：G2215539）、HSA（96%，批次：D2402300）、华法林（98%，批次：G2431127）、地高辛（92%，批次：D2313817）和溴酚蓝（BPB，98%，批次：H2205725）均购自Aladdin（中国上海）。布洛芬（98%，批次：C10142882）购自Macklin Biochemical Technology有限公司（中国上海）。实验用水为去离子水。

溶液制备

HSA（4.0 μM）储备液在pH 7.4的10 mM磷酸盐缓冲液（PBS）中新鲜配制。随后测定了HSA的浓度。

多光谱分析

多光谱分析用于揭示HSA的潜在构象变化和二级结构改变。紫外-可见光吸收光谱是验证配体-受体相互作用的可靠工具。[32] 如图1a所示，HSA在215 nm和280 nm处有两个特征吸收峰，分别对应π→π*和n→π*电子跃迁。215 nm处的强吸收峰与HSA的二级结构相关，而较弱的吸收峰...

结论

本研究通过多光谱分析、热力学分析、分子对接和分子动力学模拟，全面分析了HT与HSA之间的相互作用。紫外-可见光吸收光谱显示，随着HT浓度的增加，吸收峰发生红移，表明形成了复合物。同时，荧光淬灭和蓝移现象表明Trp/Tyr残基周围的微环境极性发生了变化。

CRediT作者贡献声明

严雄：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、资源准备、方法学设计、实验实施、概念构思。马继龙：撰写——审稿与编辑、数据可视化、软件应用、方法学设计、数据管理、概念构思。曾晓成：撰写——审稿与编辑、结果验证、软件应用、方法学设计、数据管理、概念构思。彭伟：撰写——审稿与编辑、方法学设计、数据管理。谭莎：撰写——审稿与编辑、方法学设计、数据管理。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了湖南省自然科学基金（编号：2025JJ70099）和湖南省教育厅科学研究基金（编号：22A0107）的支持。