来自钝叶螺旋藻（Spirulina platensis）的多色蛋白质的顺序下游分离策略：将热机械化学处理与高产率分离技术相结合

《Bioresource Technology Reports》：A sequential downstream strategy for polychromatic proteins from Spirulina platensis: integrating thermo-mechano-chemical disruption with high-yield fractionation

螺旋藻蛋白分阶段提取与多色分类技术研究。本研究针对螺旋藻蛋白提取效率低的问题，开发了基于热力学机械化学破坏的分阶段提取法，成功回收90.8%总可溶蛋白及14.36%叶绿素蛋白，并通过多光谱分析实现蛋白质功能特性分类，为规模化生产特种蛋白提供新路径。

　　

Neha Goel | Poonam Choudhary

生物制造工艺实验室，A区，旧生物技术大楼，生物科学与生物工程系，印度罗尔基理工学院，罗尔基，247667，北阿坎德邦，印度

摘要

藻类蛋白是新兴低碳食品经济的基石，但其工业应用受到提取效率低下的限制。主要瓶颈在于缺乏选择性破坏机制，因为高能量方法常常会无意中使目标蛋白变性，而单一流提取方法则忽略了高价值的残余生物质。由于蛋白质的回收依赖于特定参数，因此开发一种基于蛋白质性质进行分选的实验系统仍然是一个重要的技术挑战。

为了解决这些限制，本研究重点关注一种资源高效的生物精炼模型。通过采用热机械化学破坏方法，开发了一种顺序提取工艺，该工艺可回收90.80%（w/w）的总可溶性蛋白和14.03%（w/w）的藻蓝蛋白。这使得提取出的蛋白质能够被分为三种不同的多色类别：经典蓝色、深橄榄色和橄榄黄色。蛋白质表征证实，特定的处理参数决定了它们的功能特性。精确调整的提取参数可以用来调节蛋白质的功能，为大规模生产专门的藻类蛋白提供了可行的途径。

引言

藻类蛋白是满足全球蛋白质需求的丰富天然来源，尤其是在人口不断增长的情况下。Spirulina platensis是其中之一，其蛋白质含量占50–70%（w/w），并且具有优异的营养价值（Sui等人，2026年）。S. platensis具有原核细胞结构，包括纤维状荚膜、类囊体层、DNA纤维、核糖体以及独特的包涵体（Vonshak，1997年）。藻蓝蛋白复合体（Phycobilisome）是光合作用装置的重要组成部分，位于类囊体膜的细胞质表面（Arteni等人，2008年）。S. platensis更广为人知的是丝状蓝细菌，由具有四层细胞壁的圆柱形细胞组成（Eykelenburg，1977年；Vonshak，1997年）。内层包含β-1,2-葡聚糖、肽聚糖和蛋白-脂多糖层（Eykelenburg，1977年），这些层进一步被含有糖蛋白的蛋白质外壳包裹。蛋白质主要分布在细胞质、类囊体膜和包涵体中（Eykelenburg，1977年）。可溶性蛋白质位于膜的外表面，而结构蛋白则存在于肽聚糖层中。在藻蓝蛋白复合体中，藻蓝蛋白（PBPs）含量丰富，是光合作用反应的关键组成部分（Rakhimberdieva等人，2001年）。根据其在藻蓝蛋白复合体中的位置，主要的藻蓝蛋白包括位于外层的藻红蛋白（Phycoerythrin，PE）和与其相连的C-藻蓝蛋白（C-PC），两者共同形成棒状结构。内核由异藻蓝蛋白（Allophycocyanin，A-PC）组成（Izadi和Fazilati，2018年）。其独特的细胞壁结构阻碍了蛋白质的释放。为了克服这一问题，可以采用选择性提取和分选方法来保持蛋白质的结构和性质。

Spirulina蛋白在全球范围内具有重要地位，但目前市场上销售的主要是整个细胞形式的蛋白，而不是单一蛋白质提取物（Akbarbaglu等人，2023年）。据文献报道，以往的提取方法通常只关注一种蛋白质，而忽略了残余生物质。Spirulina蛋白的未开发潜力促使了大量研究致力于蛋白质提取。早期采用了多种细胞破坏和提取技术，如超声波处理、高压细胞破碎器、手动研磨和化学处理（Parimi等人，2015年；Safi等人，2014年）。同样，也有针对藻蓝蛋白提取的方法，如Benelhadj等人（2023年；Nikolova等人，2024年）。此外，还有其他组合技术的报道，强调提取特定蛋白质组分。

观察发现，冷冻解冻和超声波处理是常用的蛋白质提取方法，因为这些方法在较低温度下进行，有助于保持蛋白质的完整性。尽管这些方法与其他技术结合使用，但由于操作参数固定，往往只能提取出单一蛋白质。优化工艺参数对于提高蛋白质提取效率至关重要。目前尚无同时提取和区分多种蛋白质的策略。Spirulina蛋白的产品主要以干燥粉末、胶囊或片剂的形式销售（Thevarajah等人，2022年）。然而，根据其理化性质，这些蛋白质有可能被分离成不同类型。选择和提取技术取决于蛋白质的性质，而这方面的研究尚未充分展开。因此，开发高效提取不同蛋白质的工艺至关重要。

本研究旨在通过表征S. platensis生物质，开发一种新的提取策略，以选择、调整和设计蛋白质提取工艺。研究的目标是在不同的细胞破坏技术下通过实验方法选择工艺参数，开发出包括冷冻解冻、超声波处理、物理化学处理和中和步骤的“顺序提取工艺”，以提取不同的蛋白质。该研究还旨在提高这些被称为“多色蛋白”的蛋白质的产量和回收率。“多色蛋白”指的是“具有不同吸收峰值的多种蛋白质混合物”。细胞显微镜观察显示，在不同的细胞破坏技术下，细胞表面存在差异。提取出的蛋白质根据其理化性质进行了进一步分类。初步的蛋白质表征包括元素分析、扫描电子显微镜（SEM）、热重分析（TGA）、差热重分析（DTG）、差示扫描量热法（DSC）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）。SEM和FT-IR不仅揭示了多色蛋白之间的形态和官能团相似性，还发现了它们之间的差异。TGA和DTG分析有助于评估蛋白质的热稳定性，而DSC则测量了蛋白质的相变过程。所开发的顺序提取策略可能有助于提取特定蛋白质产品，这些产品可以进一步纯化、表征，并专门用于食品和饲料、天然色素、健康补充剂及制药等领域（Goel和Choudhary，2025年；Lobatón等人，2025年）。

材料

干燥的Spirulina platensis生物质购自位于印度孟买的Carbon Fix Solutions Pvt. Ltd公司。许多化学品，如盐酸（HCl）、碳酸钠（Na₂CO₃）、氯仿（CHCl₃）、丙酮（C₃H₆O）、氯化铝（AlCl₃）和氢氧化钠颗粒（NaOH），均从MolyChem公司购买。99.9%的纯乙醇来自MSB Chemical有限公司。所有化学品均为分析级。蒽酮试剂（97%）购自Avra Synthesis Pvt. Ltd公司。

结果与讨论

了解生物质的组成对于有针对性地提取蛋白质非常重要。生化表征有助于量化生物质中的所有代谢物，从而选择适当的裂解和提取技术来分离蛋白质和其他代谢物。

结论与未来展望

本研究开发了一种创新的顺序提取工艺，能够高效地从S. platensis中提取和回收多色蛋白。通过分选每个提取阶段的残余固体，成功回收了约90.8±2.4%（w/w）的总可溶性蛋白和14.36±0.76%（w/w）的藻蓝蛋白。结果还通过SEM观察不同细胞破坏技术下的细胞形态得到了进一步验证。这是首次进行此类研究的研究之一。

CRediT作者贡献声明

Neha Goel：撰写初稿、方法学设计、数据分析、概念构思。Poonam Choudhary：项目监督、资源协调、研究实施、资金获取、概念构思。

资金来源

本工作得到了Faculty Initiation基金（FIG）-IITR（授权号：101006）的支持。

未引用的参考文献

Li等人，2023年

利益冲突声明

无。

致谢

本工作得到了印度罗尔基理工学院生物科学与生物工程系的支持。中心的仪器设施提供了分光光度计、浓缩器、深冻柜、探针超声波仪和冷冻干燥机等设备。IIT Roorkee的生物化学工程实验室协助提供了马弗炉等设备。作者感谢仪器中心的帮助，特别是SEM、E-DAX、TGA、DTG和DSC设备的支持。