基于DTNB的新型色氨酸酶活性检测方法的开发与验证：一种用于研究应用的工具

《Enzyme and Microbial Technology》：Development and Validation of a Novel DTNB-Based Assay for Tryptophanase Activity: A Tool for Research Applications

TnaA酶活性检测新方法采用DTNB和SMC直接测定，灵敏度高、溶剂少、适合高通量，优化pH为7.8，检测限3.47U/L。

　　

Mahmoud Hussein Hadwan | Ahed Kamil Rahi | Esraa Rafied Abass | Asad M. Hadwan | Hayder Obayes Hashim | Abdulrazaq S. Alsalman | Lamia A. Almashhedy

伊拉克巴比伦省希拉市巴比伦大学科学学院化学系

摘要

色氨酸酶（TnaA）是一种依赖于吡哆醛-5’-磷酸的酶，可催化α, β-消除反应，生成吲哚、丙酮酸和氨，从而将碳代谢和氮代谢联系起来。TnaA使色氨酸能够作为碳、氮和能量的来源。此外，TnaA还能以相当的效率将S-甲基-L-半胱氨酸（SMC）转化为甲基硫醇、丙酮酸和氨，尽管其典型的底物是色氨酸。TnaA主要存在于细菌中，并具有多种生物学功能。近年来，其在代谢和细菌活动中的作用以及其在医学上的重要应用引起了广泛关注。

本文介绍了一种新的分光光度法用于检测TnaA的活性。该方法使用SMC作为底物，5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸）（DTNB）作为试剂。现有的TnaA活性定量方法通常依赖于间接检测吲哚或丙酮酸。TnaA通过切割SMC产生甲基硫醇，后者将DTNB还原为黄色色素5-硫代-2-硝基苯甲酸（TNB^-），其吸收峰位于412纳米。该反应的最佳pH值为7.8（在二氢磷酸/一氢磷酸缓冲液中），吡哆醛-5’-磷酸作为辅因子。当前方法在5–1000 U/L的范围内具有线性，相对标准偏差（RSD）≤5%，检测限为3.47 U/L。

据我们所知，这是首次报道SMC可作为分析上有用的底物来测定基于DTNB的TnaA活性，为传统的基于吲哚的检测方法提供了一种无溶剂的替代方案。DTNB–SMC方法为微生物学、代谢组学和药物发现中的TnaA研究提供了灵敏、经济且高通量的工具。

引言

色氨酸酶是一种能够将L-色氨酸降解为吲哚、氨和丙酮酸的酶[1]。有趣的是，当丙酮酸和氨的浓度较高时，它也可以逆向反应生成L-色氨酸[2]。然而，这种逆反应在热力学上更为有利，主要生成吲哚[2]。色氨酸酶需要吡哆醛-5’-磷酸（PLP）作为辅因子，并且需要单价阳离子（如钾（K+）或铵（NH4+）的存在[3]。在大肠杆菌中，该酶以四个相同亚基组成的四聚体形式存在，每个亚基的分子量为52.7 kDa[4]。每个单体结合一个PLP分子。色氨酸酶分解为单体和二聚体形式会使其失活；因此，四聚体状态对其酶活性至关重要[5]。

TnaA的生物学重要性与其未来的治疗潜力密切相关。例如，某些表达TnaA的沙门氏菌菌株可以降低肿瘤微环境中的色氨酸浓度，从而抑制癌细胞生长、减少犬尿氨酸的产生、减弱抗体反应并增强抗肿瘤免疫力[3]，[6]。此外，由于TnaA能将色氨酸转化为吲哚，因此存在防止细菌形成生物膜的潜在策略[7]。该酶的特性选择性和底物特异性也使其适用于生物催化应用，包括非典型氨基酸的合成，这促使科学家研究其结构特性和反应机制以用于酶工程[8]，[9]。这些多方面的作用凸显了TnaA在基础生物学和工业科学中的重要性。

TnaA最重要的代谢功能是参与色氨酸的分解代谢，这是细菌生存和适应环境的关键过程。吲哚作为这一生化反应的重要产物，不仅可用于检测TnaA的存在，还能区分TnaA阳性和阴性细菌[1]。此外，它通过调节色氨酸浓度来维持色氨酸的稳态，从而保持细胞稳定性并通过吲哚介导的信号传递影响微生物群落结构[2]，[5]。

已经开发了几种检测TnaA活性的方法，每种方法都有其优势和劣势，适用于特定的研究需求。大多数这些检测方法侧重于检测吲哚或丙酮酸等产物，或追踪相关的生化变化。

Kovács的方法是一种流行的比色技术，通过检测吲哚的产生来测量细菌培养物中的TnaA活性[10]。这种生物医学方法将复杂的分析简化为可管理的步骤，提高了实验室效率。与旧方法相比，它能快速提供结果，在临床环境中节省时间，并加速微生物学诊断[11]。在过去十年中，它已成为环境和临床微生物学中识别病原菌株和研究细菌代谢及环境相互作用的标准方法[12]。该方法还有助于阐明不同物种中TnaA调控的机制和变化，提供了关于细菌如何适应营养处理的见解[13]。

第二种方法通过记录色氨酸转化为丙酮酸、氨和吲哚过程中NADH在340纳米处的吸光度下降来测定TnaA活性[14]。该方法使用L-色氨酸、NADH和乳酸脱氢酶，将反应与NADH氧化耦合起来，吸光度的变化表明NADH的消耗情况。该检测方法因灵敏度和可靠性而受到认可，能够精确测量TnaA活性[14]。

一种快速且灵敏的HPLC检测方法利用荧光技术检测吲哚的形成，总孵育时间仅为20分钟[15]。吲哚和色氨酸在色谱图上的峰值为580纳米，检测灵敏度可达到几纳摩尔级别[9]。该方法在速度和效率上均优于传统方法，例如在大肠杆菌细胞中测得的平均活性为6,589.6 U/g细胞。基于荧光的检测和在线峰识别等功能提高了选择性和可靠性，适用于多种生物样本[15]。

第四种方法使用S-硝基苯基-L-半胱氨酸（SOPC）作为显色底物，该底物在TnaA的酶作用下通过α,β-消除反应水解生成o-硝基硫酚[16]。活性通过370纳米或470纳米处的分光光度法进行评估，生成物的吸收峰位于412纳米。虽然这种方法相对简单，但由于o-硝基硫酚的pKa值为5.4，因此需要将pH值调整至8.0以下以确保测量的准确性[16]。

一种经济且灵敏的检测方法使用p-二甲氨基苯甲醛（PDACA）来检测吲哚，生成可在640纳米处检测到的有色复合物[17]。反应前将吲哚提取到轻质石油中，检测限高于1 μg，相当于≤0.5单位的TnaA活性。这种快速、稳定且低成本的方法适用于多种系统，包括纯化和间接色氨酸检测[17]。

第六种方法在酸性甘氨酸-HCl缓冲液（pH 2.6）中使用亚硝酸钠产生稳定的红色，吸光度在490纳米处读取[18]。该反应只需在沸水浴中加热5分钟，无需提取吲哚，减少了其他化合物的干扰。该方法简单、快速且灵敏（可检测到超过1 μg的吲哚），已用于Aerobacter aerogenes等微生物培养物中，以及测定微量色氨酸水平[18]。

Chakravarti等人[12]开发了一种快速的比色方法，利用p-二甲氨基苯甲醛分离TnaA阳性的重组克隆和突变体，该试剂与吲哚反应生成粉红色化合物。硝酸纤维素膜上的细菌菌落被裂解并染色，从而可以区分TnaA阳性和阴性菌株以及组成型突变体。这种灵敏的方法可以快速筛选数千个不同物种的菌落[12]。表S1总结了已报道的细菌色氨酸酶（TnaA）活性检测和定量方法，包括所用底物、检测原理、测量波长、检测限（LOD）、检测时间、溶剂要求以及主要分析限制，并强调了新型DTNB–SMC分光光度法相对于传统基于吲哚的检测方法的优点。

以下是使用S-甲基-L-半胱氨酸（SMC）作为底物的新型DTNB基检测方法的详细描述。该方法通过测量酶与5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸）（DTNB）反应生成的甲基硫醇来量化酶活性，该色素在412纳米处可被检测到。该协议相比现有方法有显著改进：它使用96孔微孔板读数器同时分析数百个样本，无需有机溶剂，提高了环境可持续性，增强了灵敏度和特异性，简化了常规实验室操作。DTNB-SMC方法解决了当前的分析挑战，为研究人员提供了有效、精确且环保的生化研究工具。

化学试剂

丙酮酸钠（Sigma Aldrich）、吡哆醛-5’-磷酸、S-甲基-L-半胱氨酸、吲哚、二钠EDTA、p-二甲氨基苯甲醛、p-二甲氨基苯甲醛、戊醇、Tris（羟甲基）氨基甲烷（Tris）和色氨酸均购自上海Macklin生化有限公司。Ellman试剂（5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸）（DTNB）购自HiMedia。磷酸一钾、氢氧化钠（NaOH）、盐酸（HCl）以及所有其他化学品也均从相同来源购买。

检测原理与优化

经典的TnaA酶催化两种主要类型的反应[22]，[23]。首先，它催化α,β-消除反应： L-R-CH?-CH(NH?)-COOH + H?O → R-H + NH? + CH?-CO-COOH

其次，它促进α,β-取代反应： L-R'-CH?-CH(NH?)-COOH + R-H ? L-R-CH?-CH(NH?)-COOH + R'-H

在这些反应中，R通常代表吲哚基或其适当取代的变体，而R'可能包含如-SH、-SCH?、-SCH?CH?、-OH、-OCH?、-NH?等功能基团

结论

本文介绍的基于DTNB的检测方法代表了TnaA活性检测方面的重大技术进步。该方法依赖于TnaA对SMC的酶促水解，生成甲基硫醇。甲基硫醇进一步与DTNB反应，DTNB被还原为黄色色素5-硫代-2-硝基苯甲酸，反应在412纳米处通过分光光度法进行读取。这种直接的光学方法消除了对最终产物的间接检测需求，提供了简单而灵敏的读数结果

资助情况

无

CRediT作者贡献声明

Mahmoud Hussein Hadwan：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、可视化、验证、监督、软件使用、资源管理、项目协调、方法学设计、实验设计、资金获取、数据分析、概念化。 Lamia A. Almashhedy：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、方法学设计、实验设计、数据分析。 Abdulrazaq S. Alsalman：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、方法学设计、实验设计、数据分析。

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本文时，作者使用了poe.com工具对部分段落进行了语言校正。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对最终发表负责。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文工作的财务或个人利益冲突。

致谢

无

作者协议声明

我们声明本手稿是原创的，之前未发表过，也未被其他地方考虑发表。

我们确认所有署名作者均已阅读并批准了本手稿，且没有其他符合作者资格但未列出的人士。我们还确认所有人都同意手稿中列出的作者顺序。

我们理解通讯作者是唯一的联系人