《Experimental Parasitology》：Comprehensive molecular characterization of Theileria equi: Detection, genetic diversity, and risk factors assessment
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本研究分析印度哈里亚纳邦306例马匹血液样本，发现显微镜检测阳性率10.78%，PCR检测21.24%。所有样本属基因型A，18S rRNA和EMA-1基因分析揭示全球46种单倍型，印度存在3种，单倍型多样性高（Hd=1.0）。Logistic回归显示夏季、蜱虫寄生、农场有反刍动物、贫血和血尿为感染显著预测因素。结论印度梨浆虫种群遗传多样性低但单倍型多样性高，可能为近期扩张所致。
比斯瓦·兰詹·马哈拉纳（Biswa Ranjan Maharana）|阿尼塔·甘古利（Anita Ganguly）|拉什米·马利克（Rashmi Malik）|安基特·库马尔（Ankit Kumar）|苏乔伊·卡纳（Sujoy Khanna）|比诺德·库马尔（Binod Kumar）|桑迪普·波特利亚（Sandeep Potliya）|哈普里特·辛格（Harpreet Singh）|艾什瓦里亚·达什（Aishwarya Dash）|苏巴希什·萨胡（Subhasish Sahu）
印度哈里亚纳邦卡纳尔（Karnal）乌查尼（Uchani）的拉拉·拉杰帕特·赖大学兽医与动物科学学院（Lala Lajpat Rai University of Veterinary and Animal Sciences），邮编132001
摘要
由Theileria equi引起的马匹梨形虫病（equine piroplasmosis）已在全球范围内得到广泛研究，但在印度的遗传多样性研究仍较为有限。通过对306份马血样本的分析，显微镜检测显示10.78%的样本感染了T. equi，PCR检测显示21.24%的样本感染了T. equi。本研究使用了针对T. equi和Babesia caballi的18S rRNA的通用引物，随后通过物种特异性引物生成了435 bp的扩增子。对PCR阳性样本进行测序后发现高度同源性（印度为99.52–100%，全球为95.89–100%），所有印度分离株均被归类为基因型A。EMA-1基因的系统发育分析进一步验证了18S rRNA基因分析的结果。基于18S rRNA的中值连接网络（median-joining network）识别出46种全球单倍型，其中Hap_1最为常见，并显示出地理聚集现象。巴西拥有最多的单倍型（n = 13），其次是斯里兰卡（n = 11）、以色列（n = 9）、南非和中国（各n = 6）、瑞士（n = 4）以及印度（n = 3）。星状网络（star-like network）表明该物种经历了快速的人口扩张和新单倍型的出现。尽管T. equi的总体核苷酸多样性较低（π = 0.172 ± 0.007），但其单倍型多样性较高（Hd = 1.0 ± 0.005），这表明单倍型之间的差异较小且近期发生了种群扩张。AMOVA分析显示基因型间的遗传变异（78.61%）大于基因型内的变异（21.39%），且存在显著差异（Fst > 0.33）。逻辑回归模型显示，夏季（OR = 3.129；p = 0.012）、蜱虫侵扰（OR = 2.988；p = 0.031）、农场中存在反刍动物（OR = 5.865；p = 0.004）、贫血（OR = 4.231；p < 0.001）和红色尿液（OR = 4.892；p = 0.017）是马匹T. equi感染的重要预测因素。而雨季、年龄、性别、管理方式和身体状况等因素则不具有显著预测作用（p > 0.05）。
引言
由Theileria equi引起的马匹梨形虫病对全球马匹种群构成了重大经济威胁（Knowles等人，1992年；Uilenberg，2006年；Rizk等人，2015年、2022年）。虽然在其他地区也观察到Babesia caballi的共感染（de Waal和van Heerden，2004年），但在印度T. equi似乎是主要病原体。该病的临床表现非特异性，从轻微到严重不等，使得诊断较为困难。感染后的马匹在急性期过后往往成为无症状携带者（de Waal，1992年；Wise等人，2014年；Tirosh-Levy等人，2020年；El-Sayed等人，2020年；Rizk等人，2022年）。T. equi已在印度多个地区被报道，对马产业造成了影响（Sudan等人，2013年；Kumar等人，2013年、2021年；Sumbria等人，2016a、2016b年；Dahiya等人，2018年）。
准确的病原体鉴定对于有效管理该疾病至关重要。尽管显微镜检查是金标准，但在无症状或寄生虫血症较低的情况下其敏感性有限（Baptista等人，2013年）。血清学检测虽然常用，但由于交叉反应性可能不可靠（Allred，2003年）。分子方法（如PCR）具有更高的敏感性和特异性，能够检测到低水平的感染（Alhassan等人，2005年；Heim等人，2007年）。针对β-微管蛋白（Caccio等人，2000年）、EMA-1（Battsetseg等人，2002年；El-Sayed等人，2020年）、EMA-2（El-Sayed等人，2015年）和18S rRNA（Nagore等人，2004年；Ahedor等人，2023年）的PCR方法已被广泛用于梨形虫的检测。18S rRNA基因因其较低的突变率、保守的功能和多个拷贝而成为系统发育和分类的关键标记（Chae等人，1999年；Qablan等人，2013年）。利用该基因对T. equi进行的系统发育分析确定了五种不同的基因型（A–E）（Liu等人，2016年；Ketter-Ratzon等人，2017年）。同样，对红细胞侵入至关重要的EMA-1蛋白在ELISA诊断中也被广泛应用，并表现出遗传多样性，可分为三个组别，使其成为研究T. equi种群变异的理想目标（Bhoora等人，2010年；Tirosh-Levy等人，2020年；Coultous等人，2022年）。
尽管T. equi已在印度不同地区被报道，但大多数研究主要集中在检测或部分分子特征分析上，对种群内遗传多样性和其流行病学相关因素的探索有限（Kumar等人，2020年、2021年）。结合基因型特征分析、基于单倍型的多样性分析和宿主-管理风险因素评估的综合研究仍然较少。本研究通过整合流行病学因素、分子检测和遗传多样性评估，主要通过18S rRNA特征分析并辅以EMA1基因分析，为印度背景下的寄生虫种群结构和感染动态提供了新的见解。
伦理批准
本研究遵循了标准的伦理指南，并获得了印度希萨尔（Hisar）拉拉·拉杰帕特·赖大学兽医与动物科学学院（LUVAS）机构动物伦理委员会的批准（IAEC/LUVAS/30/01）。
研究区域
哈里亚纳邦位于印度北部（纬度范围为27°39′至30°35′ N，经度范围为74°28′至77°36′ E），夏季炎热，冬季温和。该地区气候干燥至半干旱，年平均降雨量为354.5毫米，有利于蜱虫等媒介的生存。
通过显微镜和PCR进行样本筛查
使用显微镜在33份马血样本中检测到了Theileria equi梨形虫（10.78%）。这些寄生虫表现出多种形态，包括不规则的梨形和环状结构。
样本接受了针对18S rRNA基因的PCR检测，以识别T. equi和/或B. caballi的DNA。引物对Bec-UF1/Bec-UR可扩增出特异性针对T. equi DNA的913 bp片段（补充图S1）。在测试的306份样本中，有65份（21.24%）对T. equi呈阳性。
讨论
由T. equi和B. caballi引起的马匹梨形虫病对热带和亚热带地区的马匹健康构成重大风险，对国际马贸易也有影响（Ros-Garcia等人，2013年）。虽然T. equi在印度非常普遍，但B. caballi感染的报道较少（Sumbria等人，2016a、2016b年）。本研究区域毗邻一些T. equi高发地区（Sumbria等人，2016b年；Dahiya等人，2018年）。
结论
本研究首次对印度北部的T. equi进行了全面的分子特征分析。18S rRNA和EMA-1基因的系统发育分析表明，所有印度分离株都属于基因型A。印度T. equi分离株表现出较高的单倍型多样性（h = 1.0）。总体而言，T. equi基因型的核苷酸多样性较低，但单倍型多样性较高，表明种群间存在显著的基因组差异。
CRediT作者贡献声明
比斯瓦·兰詹·马哈拉纳（Biswa Ranjan Maharana）：负责撰写、审稿与编辑、原始草稿的撰写、软件使用、方法论设计、实验实施、数据分析及数据整理。阿尼塔·甘古利（Anita Ganguly）：负责撰写、原始草稿的撰写、方法论设计及数据整理。拉什米·马利克（Rashmi Malik）：负责撰写、审稿与编辑、方法论设计及数据整理。安基特·库马尔（Ankit Kumar）：负责撰写、审稿与编辑、方法论设计及数据整理。苏乔伊·卡纳（Sujoy Khanna）：负责撰写、审稿与编辑、方法论设计及数据整理。比诺德·库马尔（Binod Kumar）：负责撰写、审稿与编辑、方法论设计及数据分析。
资金支持
作者获得了希萨尔拉拉·拉杰帕特·赖大学兽医与动物科学学院研究主任的资助。
致谢
作者衷心感谢希萨尔拉拉·拉杰帕特·赖大学研究主任和副校长提供的研究设施和财政支持。
