用于尿液样本中恶性疟原虫和阴道毛滴虫多重检测的等温扩增技术开发及其在临床诊断中的应用

《ACS Omega》：Multiplexed Isothermal Amplification Assay for the Detection of Plasmodium falciparum and Trichomonas vaginalis in Urine

本刊推荐一项创新诊断技术研究。针对资源有限地区疟疾和阴道毛滴虫病共感染诊断难题，研究人员开发了一种基于等温扩增（iso-IMRS）和侧向层析（LFA）读出的多重检测方法。该技术利用尿液样本实现了对恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）和阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）的高灵敏度（检测限分别达0.571和1.027 copies/μL）、特异性同步检测。其操作简便、耗时短（<45分钟），且无需复杂仪器，有望为近患者检测（POC）提供一种低成本、无创的现场诊断方案，对改善撒哈拉以南非洲等地的孕产妇健康具有重要意义。

　　

在资源有限的地区，特别是撒哈拉以南非洲，由恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）引起的疟疾和由阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）引起的滴虫病是两大严重的公共卫生威胁。更棘手的是，这两种感染在孕妇中常常“携手作恶”，形成共感染，从而加剧不良的母婴结局，如孕产妇贫血、低出生体重、早产以及母婴死亡率上升。然而，传统的诊断方法在这场“捉虫”大战中显得有些力不从心。对于疟疾，尤其是妊娠期疟疾，由于恶性疟原虫能够隐藏在胎盘中（称为胎盘隔离现象），导致孕妇外周血中的寄生虫载量很低，这使得显微镜检查或快速诊断试纸（Rapid Diagnostic Tests, RDTs）等常规工具的漏诊率很高。而对于滴虫病，常用的湿片镜检法灵敏度较低，培养法则耗时长达数天。虽然聚合酶链式反应（PCR）技术灵敏度高，被誉为“金标准”，但它需要昂贵且不易移动的热循环仪和专门的实验室环境，在资源匮乏的现场难以施展拳脚。因此，迫切需要一种能在诊所、社区等“近患者”地点（Point-of-Care, POC）使用的、快速、灵敏且能同时检测这两种病原体的诊断工具。为此，一项发表在《ACS Omega》杂志上的研究，探索了一种全新的解决方案：利用尿液这种无创样本，开发一种名为“多重等温多重复序列扩增”（multiplexed isothermal amplification assay， iso-IMRS）的检测方法。

研究者们采用了几个关键的技术方法来构建并验证这一诊断平台。首先，他们利用“相同多重复序列”算法，从阴道毛滴虫和恶性疟原虫的基因组中分别筛选出特异性的引物对，这些引物能在目标基因组的多位点结合，从而即使目标DNA有降解也能实现高效扩增。其次，他们针对尿液样本中存在的尿素、盐离子等PCR抑制物，创新性地采用了分子量截留为7 kDa的脱盐层析柱对样本进行快速前处理，以去除抑制剂并浓缩病原体DNA。随后，建立了优化的等温扩增体系，在60°C恒温条件下反应30分钟，即可同时扩增两种病原体的DNA。最后，使用带有抗地高辛和抗荧光素抗体的侧向层析试纸条，通过与扩增产物上的生物素及相应抗原结合，实现结果的快速可视化判读，整个过程无需复杂仪器。研究使用了人工尿液和商业采购的混合人尿作为基质，并用定量基因组DNA进行加标实验来评估性能。

研究结果通过一系列精心设计的实验得以展示。

在反应条件优化中，研究人员系统性地测试了温度、引物浓度、添加剂等多个参数。最终确定了最佳反应体系：60°C反应温度，阴道毛滴虫正向引物浓度为3.2 μM，其他引物为2 μM，添加3% DMSO、800 U/mL Bst2.0 DNA聚合酶、4% Ficoll 400和0.4 M甜菜碱。这些优化显著提高了扩增效率和重现性。

在单重检测性能评估中，阴道毛滴虫单重等温多重复序列扩增实验显示，该方法在人工尿液中表现出优异的灵敏度。通过侧向层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳均证实，其检测下限可达10^-1copies/μL。进一步的实时荧光扩增结合概率回归分析计算出其分析灵敏度（95%置信度下可检测的浓度）为0.62 copies/μL。

随后，研究扩展到多重等温多重复序列扩增。在未经处理的人工尿液中，该多重检测方法对两种病原体的检测限分别为：阴道毛滴虫10⁰copies/μL，恶性疟原虫10⁰copies/μL。

然而，当使用未处理的加标人尿时，检测灵敏度显著下降。为解决此问题，研究人员引入了人尿制备步骤，使用脱盐层析柱去除抑制剂。这一预处理步骤仅需约5分钟，且只需低速离心机。处理后的样本再进行多重检测，灵敏度得到极大提升，对两种病原体的检测限均达到了10⁰copies/μL。

对处理后样本进行概率回归分析，确定了该方法在多重检测模式下的分析灵敏度：恶性疟原虫为0.571 copies/μL，阴道毛滴虫为1.027 copies/μL，证明了其高灵敏度。

至关重要的是，该方法展现了高度的特异性。研究人员测试了包括其他疟原虫（如间日疟原虫 P. vivax）、性传播病原体（如沙眼衣原体 C. trachomatis、淋病奈瑟菌 N. gonorrhoeae）以及其他可能共存的微生物在内的多种非靶标基因组物质。结果表明，该方法的两种病原体特异性引物组均未发生交叉反应，仅在含有目标DNA的反应中观察到特异的扩增条带。

在讨论部分，研究者将iso-IMRS与现有诊断方法进行了详细比较。显微镜检查灵敏度有限且依赖专业人员；RDTs（快速诊断试纸）虽然快速，但对无症状感染的检出限不够低，且通常针对血液而非尿液优化；定量PCR（qPCR）虽灵敏，但设备昂贵、耗时较长，不适合现场使用；环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术虽灵敏，但样本前处理（如高速离心、高温加热）步骤复杂，总耗时更长。相比之下，本研究开发的iso-IMRS方法集多项优势于一身：其分析灵敏度接近PCR水平（约1 copy/μL），总检测时间短（约45分钟），仅需加热块和低速离心机等简单设备，并结合了适合现场使用的侧向层析试纸条读出方式。特别值得一提的是，研究首次报道了使用脱盐层析柱对尿液进行快速前处理，以有效去除扩增抑制剂，这是一个新颖且实用的策略。

研究的结论明确指出，这项研究成功证明了一种用于同时检测恶性疟原虫和阴道毛滴虫的多重等温扩增检测方法的可行性。该方法采用尿液作为无创样本基质，通过简化的引物设计和等温扩增化学体系，在保持与PCR相媲美的高灵敏度的同时，大幅降低了对设备的要求并简化了样本制备流程。结合侧向层析读出，整个工作流程（包括样本处理、扩增和结果读取）可在1小时内完成，展现出在资源有限地区、尤其是作为产前护理一部分进行近患者检测的巨大潜力。这项研究为开发灵活、适用于现场的分子诊断平台铺平了道路。未来的工作将集中于进一步减少预处理步骤、在临床患者样本中进行验证，并扩展其多重检测能力以覆盖更广泛的传染病监测需求。