改进胶质纤维酸性蛋白诊断方法以实现院前中风分诊

《Neurology Open Access》：Refining Glial Fibrillary Acidic Protein Diagnostics for Prehospital Stroke Triage

　　摘要
背景与目标
当在院前环境中怀疑中风时，能够排除所有救护车中的颅内出血（ICrH）将有助于指导分诊决策、早期管理血流动力学，并帮助准备接收医院。在这项前瞻性观察研究中，我们调查了血浆胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在急性 cerebral ischemia（ACI）和中风模拟（SM）患者中超早期排除 ICrH 的诊断性能，研究对象是一个大型、未经筛选的中风代码患者队列。

方法
使用 AlphaLISA 在现场收集的样本和入院时进行血浆 GFAP 的实验室测量，并计算两个样本之间的 GFAP 变化率（pg/mL/min）。通过接收者操作特征曲线（AUC-ROC）分析和绘图来研究 GFAP 排除 ICrH 的能力，并计算诊断指标。

结果
我们共纳入了 999 名患者（129 例 ICrH、657 例 ACI、213 例 SM）。年龄的中位数四分位数范围（IQR）为 69（58–79）岁，男女比例为 56.2%/43.8%。最后一次已知健康状态到采样的时间中位数分别为 60（39–115）分钟（院前样本）和 98（72–152）分钟（入院样本），两次采样之间的时间为 31（25–42）分钟。通过单次采样的院前 GFAP 测量来排除 ICrH 在整个队列中的表现尚可（AUC 0.789 [95% CI 0.743–0.834]），而对于女性患者，AUC 为 0.841（95% CI 0.779–0.904），而对于 75 岁以上患者，AUC 为 0.858（95% CI 0.794–0.923）。使用基于年龄（<60、60–75、>75 岁）和性别的临界值，单次采样的 GFAP 可以以高确定性（阴性预测值 [NPV] 98.5%）排除 51.5% 的 ACI/SM 患者（ICrH 的敏感性为 94.6%，特异性为 51.5%，阳性预测值 [PPV] 为 22.4%）。通过两次采样的 GFAP 变化率以及基于年龄和性别的临界值，可以以高确定性（NPV 98.0%）排除 74.0% 的 ACI/SM 患者（ICrH 的敏感性为 89.9%，特异性为 74.0%，PPV 为 33.9%）。

讨论
使用基于年龄和性别的临界值，单次采样和两次采样的 GFAP 测量策略在排除 ICrH 方面的诊断性能得到改善。这些发现为未来的院前中风诊断中的即时 GFAP 测量诊断试验提供了指导。在运输距离较长或即时 GFAP 测量速度可以提高的情况下，实际应用两次采样的 GFAP 测量将具有重要意义。

引言
对于疑似急性中风的患者，及时诊断和治疗可以改善预后。1,2 具有 CT 成像能力的中风救护车经验显示，早期区分主要诊断亚组（颅内出血 [ICrH]、急性 cerebral ischemia [ACI] 和中风模拟 [SM]）有很多益处。这些益处包括改善分诊和运输决策、提前准备接收医院以及院前开始治疗。3-5 然而，移动式中风单元的普及进展缓慢，因此开发新的诊断方法对所有紧急医疗服务机构（EMS）单元将非常有益。6 基于血液的生物标志物有望实现简单、快速且经济高效的即时中风诊断。7,8 在急性中风患者的院前鉴别诊断中，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是一个主要的生物标志物候选者。ICrH 患者的血浆 GFAP 水平迅速升高，而在 ACI 和 SM 患者中，GFAP 水平升高较慢且幅度较小，因此必须快速排除 ICrH。9 到目前为止，GFAP 在急性中风中的诊断性能主要通过在院前阶段之后、到达医院后进行的血液样本研究得到支持。9 最近的更大规模研究显示更早和更相关的院前采样进一步支持了 GFAP 用于院前诊断的适用性。10,11 最近，Kalra 等人在一个中风代码（SC）队列（n = 353）中研究了 GFAP 的诊断性能，其中院前采样的中位延迟时间为症状出现后 90 分钟，SM 病例的比例较低（5.4%）。在这个队列中，通过选择最佳临界值，血浆 GFAP 的测量可以高确定性（阴性预测值 [NPV] 97.8%、特异性 48.4%、敏感性 96.1%、阳性预测值 [PPV] 33.8%）排除颅内出血。此外，发现 GFAP 水平随年龄增长而升高，这与之前在健康成年人中的研究一致，12 这表明在选择 GFAP 临界值时应考虑患者年龄。11 在本研究中，为了加强先前发现的普遍性，我们调查了一个大型（n = 999）且未经筛选的中风代码患者队列（SM 病例比例为 21.3%），采用超早期双时间点采样（从症状出现到采样的中位数分别为 60 分钟和 98 分钟），以进一步开发特定的 ICrH 排除方法。特别是，我们研究了基于年龄和性别的临界值的附加效益。此外，为了在运输距离较长的农村地区使用，我们还研究了一种使用院前 GFAP 变化率计算的双时间点采样策略来改进诊断。

方法
研究设计和设置已在文献中详细描述。12-14 简而言之，赫尔辛基和乌西马地区的医院区覆盖约 160 万人口；其 EMS 在中央管理下运作。在研究招募期间，EMS 使用面部-手臂-言语测试（Face Arm Speech Test）来识别急性中风，包括评估下肢无力。可以通过电话咨询值班神经科医生或 EMS 医生。被认为是需要再通治疗的患者会被作为高优先级的 SC 患者运送至赫尔辛基大学医院（HUH），该医院接收该地区的所有 SC 患者。被认为是需要神经外科紧急治疗的患者会被送往另一家神经外科医院。赫尔辛基超急性中风生物标志物研究于 2013 年 5 月 20 日至 2015 年 11 月 19 日期间招募患者。纳入标准包括主要 SC 转运至 HUH、年龄 ≥18 岁以及有处理的血液样本。从医院病房或其他急诊科转运是预先规定的排除标准。在研究期间，共有 2392 名 SC 患者被转运至 HUH。我们所有的 EMS 人员都接受了研究招募和血液采样的重复培训。由于招募依赖于 EMS 人员的自愿参与，因此招募的 SC 患者代表了一个方便样本。在符合我们招募标准的 1,079 名患者中，有 61 人未能提交最终书面同意书；包括没有 EMS 或医院记录的 3 名患者，最终得到 1,015 名患者作为研究队列。13 在这个队列中，我们进一步排除了 8 名因样本量不足的患者和 8 名没有入院影像学检查的患者，最终共有 999 名患者用于分析。在所有随访调查完成后，我们通过电子病历审查收集数据，每个最终诊断组（ICrH、ACI 或 SM）根据所有可用的患者记录进行分类。缺血性中风（IS）和短暂性脑缺血发作（TIA）患者被归类为 ACI 组，因为这些患者在院前阶段都有持续的 ACI 症状。

血液采样
EMS 人员在所有 SC 患者转运前常规放置大口径肘前导管。导管放置后立即，使用导管适配器（Vacutainer Luer-Lok 适配器，BD）将预 hospital 样本收集到容量为 5.5 mL 的真空管中（含有血清和钾 EDTA，Venosafe，Terumo），并记录采样时间。患者到达急诊科后，实验室工作人员收集预 hospital 样本，并通过静脉穿刺将入院样本收集到等容的 10 mL 真空管中。最后，样本在医院实验室中以 20°C 下离心 2000 秒；血浆和血清被分装到冷冻管中并存放在 -80°C。

血浆 GFAP 的测量
我们使用自 2024 年春季开始商业出售的 AlphaLISA 人用和鼠用 GFAP 检测试剂盒（Revvity）进行血浆 GFAP 的测量。AlphaLISA 是一种快速、高灵敏度的无需洗涤的免疫测定方法。15 测量按照试剂盒说明进行，使用包含的抗体，在 EnVision 分析仪（Revvity）上的 ?Area AlphaPlate 96 孔板上进行。我们分析了每位患者的一对连续样本，每个样本在相邻孔中进行三次重复测量。为了优化测定性能，如果任一样本的三次重复测量的孔间变异系数（CV）超过 15%，或者任一样本的测量值超过 3,000 pg/mL 需要稀释，我们将重新分析这两个患者样本。尽管该测定的报告下限为 14.0 pg/mL，但我们发现测量值 <100 pg/mL 的样本的三次重复测量的 CV 一致较高，重新分析的意义有限。因此，如果三次重复测量的 CV 超过 15%，这些样本将不会被重新分析，并且没有选择低于此水平的诊断临界值。所有样本中 GFAP 水平 <100 pg/mL 的比例分别为 13.5% 和 15.3%。我们将下限设定为 30 pg/mL，所有低于此水平的样本均报告为 30 pg/mL。

内部质量控制（人 plasma）对于低浓度（284.2 pg/mL）的 CV 为 11.4%，而两项测定之间的 CV 为 17.8%。对于高浓度质量控制样本（3,831.0 pg/mL，稀释 10 倍），相应的 CV 分别为 9.6% 和 16.2%。这些变异系数与北欧领先神经化学实验室使用的高灵敏度 SIMOA 平台观察到的结果一致（对于 241.1 pg/mL 的样本分别为 8.6% 和 14.5%）。10 测量在 2024 年 4 月至 6 月期间在芬兰赫尔辛基大学 Biomedicum 的临床神经病学研究单元进行，未涉及患者的临床特征。

统计分析
分类变量以绝对计数和百分比的形式报告，连续变量以中位数和四分位数范围（IQR）的形式报告。根据成人基线 GFAP 水平，年龄分为 <60、60–75 和 >75 三个组。12 非参数的 Spearman 秩检验用于测量相关性。对于单变量分析，我们使用 Mann-Whitney U 检验；对于多变量分析，我们使用线性回归模型。对于线性模型，我们使用预 hospital GFAP 的对数（ln）作为因变量，以确保线性。由于年龄和预 hospital GFAP 之间存在强烈的相关性，我们没有建立包括年龄、女性性别和预 hospital GFAP 的逻辑回归模型来预测 ICrH。通过接收者操作特征曲线（AUC）分析来探讨血浆 GFAP 排除 ICrH 的能力。AUC 小于 0.7 被认为是较差的，0.7–0.8 是中等的，0.8–0.9 是良好的，0.9–1.0 是优秀的。16 我们还通过交叉制表计算诊断指标来进一步评估血浆 GFAP 的诊断性能。根据 AUC 分析和绘图选择临界值，以提供整个队列的高（≥98.0%）NPV，即高确定性排除 ICrH。对于单次采样的 GFAP 测量，这需要一个临界值；而对于双时间点 GFAP，我们根据初始预 hospital GFAP 浓度和预 hospital GFAP 变化率建立了临界规则。10 简而言之，我们之前已经证明，急性 ICrH 病例要么表现出高初始 GFAP 水平，要么表现出中等初始 GFAP 水平伴随着高 GFAP 变化率。10 因此，双时间点临界规则结合了两条独立的规则来识别这两组（即初始 GFAP 水平高的病例和初始 GFAP 水平中等且 GFAP 变化率高的病例）。所有比较的显著性设置为 p ≤ 0.05。分析使用 SPSS（v.26，IBM）进行。

标准协议批准、注册和患者同意
赫尔辛基超急性中风生物标志物研究获得了当地机构审查委员会（39/13/03/01/2012）和机构伦理委员会的批准，并作为前瞻性观察研究注册（NCT02145663，clinicaltrials.gov）。每位患者或其亲属提供了书面知情同意书，这些同意书在患者到达医院后收集，以避免之前描述的运输或急性治疗的任何延误。10,13,14

结果
人口统计和采样延迟
在 999 名患者中，最终诊断组分别为 ACI 657 名（65.8%）、SM 213 名（21.3%）和 ICrH 129 名（12.9%）（表 1）。ICrH 组中包括 85 名（65.9%）ICrH 患者、1 名（0.8%）蛛网膜下腔出血患者、8 名（6.2%）硬膜下出血患者、29 名（22.5%）混合型 ICrH 患者、4 名（3.1%）肿瘤相关 ICrH 患者以及 2 名（1.6%）亚急性梗死的出血转化患者。初始预 hospital 样本的中位数 LKW 到采样时间范围为 60（39–115，范围 14–1,049）分钟，入院样本的中位数 LKW 到采样时间范围为 98（72–152，范围 38–1,080）分钟（表 1），两次采样之间的时间为 31（25–42）分钟。院前样本在“黄金时间”（距离最后一次就诊<1小时）内从468名患者（46.8%）处采集，在<2小时内从728名患者处采集（72.9%），在<3小时内从839名患者处采集（84.0%）。详见表格1：人口统计特征。

表1：人口统计特征
变量 最终诊断 总数（n = 999） ICrH（n = 129） ACI（n = 657） SM（n = 213）
年龄（岁），中位数（IQR） 69（58–79） 70（59–77） 71（62–80） 62（48–72）
<60岁 268（26.8%） 33（25.6%） 133（20.2%） 102（47.9%）
60–75岁 405（40.5%） 57（44.2%） 277（42.2%） 71（33.3%）
>75岁 326（32.6%） 39（30.2% 247（37.6%） 40（18.8%）
性别，女性 438（43.8%） 48（37.2%） 271（41.2%） 119（55.9%）
性别，男性 561（56.2% 81（62.8%） 386（58.8%） 94（44.1%）

病史 高血压 606（60.7%） 85（65.9%） 405（61.6%） 116（54.5%）
高脂血症 444（44.4%） 48（37.2%） 307（46.7%） 89（41.8%）
糖尿病 158（15.8%） 20（15.5%） 104（15.8%） 34（16.0%）
心房颤动 205（20.5%） 24（18.6% 157（23.9%） 24（11.3%）
缺血性心脏病 164（16.4%） 12（9.3%） 131（19.9%） 21（9.9%）
既往脑卒中 153（15.3%） 10（7.8%） 98（14.9%） 45（21.1%）
短暂性脑缺血发作 87（8.7%） 7（5.4%） 60（9.1% 20（9.4%）
既往颅内出血/蛛网膜下腔出血 23（2.3%） 1（0.8%） 16（2.4% 6（2.8%）

入院时的NIHSS评分 中位数（IQR） 4（2–9） 12（6–17） 4（2–9） 2（1–4）
NIHSS评分分组 0–5 577（59.1%） 25（21.0%） 386（59.0%） 166（81.4%）
6–10 187（19.1%） 30（25.2%） 131（20.0%） 26（12.7%）
11–15 95（9.7%） 27（22.7%） 63（9.6%） 5（2.5%）
16–21 93（9.5%） 26（21.8%） 62（9.5%） 5（2.5%）
≥22 25（2.6%） 11（9.2%） 12（1.8% 2（1.0%）

从最后就诊到样本采集的时间（分钟），中位数（IQR）：
院前样本 60（39–115） 53（40–81） 59（37–120） 70（45–122）
入院样本 98（72–152） 95（70–124） 93（70–156） 106（80–159）

缩写说明：
ACI = 急性脑缺血；ICH/SAH = 颅内出血/蛛网膜下腔出血；ICrH = 颅内出血；IQR = 四分位数范围；IS = 缺血性中风；LKW = 最后已知健康时间；NIHSS = NIH中风评分；SM = 类中风症状；TIA = 短暂性脑缺血发作。

年龄与性别与GFAP水平的关联：
年龄在ICrH组（ρ = 0.261，p = 0.003）和ACI + SM组（ρ = 0.576，p < 0.001）中与院前GFAP水平相关。在这两组中，女性患者的院前GFAP水平显著高于男性患者：ICrH组（p = 0.005）和ACI + SM组（p < 0.001）。在多变量线性回归模型中，年龄和女性性别是院前GFAP水平升高的独立预测因素（见表2）。

表2：多变量分析
模型1：线性回归
独立预测因子：升高的院前GFAP
变量 B（95%置信区间） SE β p值
急性颅内出血 1.584（1.346–1.822） 0.121 0.350 <0.001
女性性别 0.247（0.085–0.410） 0.083 0.081 0.003
年龄（岁） 0.040（0.034–0.045） 0.003 0.380 <0.001

使用单时间点GFAP排除ICrH：
所有患者中，AUC为0.789（95%置信区间0.743–0.834）；男性患者中为0.770（95%置信区间0.711–0.829）；女性患者中为0.841（95%置信区间0.779–0.904）（图1A）。按年龄分层后，<60岁患者的AUC为0.802（95%置信区间0.726–0.878），60–75岁患者为0.803（95%置信区间0.737–0.868），>75岁患者为0.858（95%置信区间0.794–0.923）（图1B）。

使用双时间点GFAP排除ICrH：
单时间点GFAP在所有患者中的AUC为0.789（95%置信区间0.743–0.834）；男性患者中为0.770（95%置信区间0.711–0.829），女性患者中为0.841（95%置信区间0.779–0.904）。通过选择最佳临界值后，单时间点院前GFAP在51.5%的ACI + SM患者中能够高度确信地排除ICrH（阴性预测值NPV为98.5%）（敏感性为94.6%，特异性为51.5%，阳性预测值PPV为22.4%）（图2和表3）。

使用双时间点GFAP排除ICrH：
结合初始院前GFAP和随时间变化的GFAP变化率，可以更准确地区分ICRH和ACI + SM患者（图3）。当为每个年龄和性别组选择最佳临界值时，结合这两个指标可以高度确信地排除ICRH（阴性预测值NPV为98.0%）（敏感性为89.9%，特异性为74.0%，阳性预测值PPV为33.9%）。通过在结果中引入随机变异，这可能会影响研究的准确性，从而低估GFAP在区分不同诊断组方面的能力。目前，尚不存在确保GFAP检测方法之间可比性的通用标准，因此无法直接比较不同检测方法报告的浓度值。在有限的内部测试中，我们发现AlphaLISA检测方法比最近发布的iSTAT血浆TBI POC检测方法更敏感，AlphaLISA能够检测到高达204 pg/mL的样本，而iSTAT检测方法在这些样本上无法显示出量化结果，这表明AlphaLISA检测方法的灵敏度更高。尽管在报告浓度低于100 pg/mL时AlphaLISA的技术变异性有所增加，但由于无需设定低于该水平的临界值，这对报告的诊断结果没有显著影响。然而，有相当比例的患者（15.3%）的浓度低于这一水平，这表明当前的GFAP检测技术仍有改进的空间。

尽管我们已经证明，根据年龄和性别设定的GFAP临界值可以显著提高诊断效果，但在实际应用中需要使用无需离心血浆的全血GFAP POC检测方法。由于全血在长期冷冻储存过程中红细胞会溶解，因此无法仅通过预先收集的样本集来确定全血检测方法的最佳临界值。因此，最终的诊断临界值的选择将基于实际应急医疗服务（EMS）中的使用情况，并针对每个EMS地区分别进行，因为这些临界值会受到人口统计特征、疑似卒中患者（SC patient）的选择标准、采样延迟、环境因素、技术技能以及所使用检测方法的影响。未来，GFAP POC仪器可以设计为包含根据患者年龄和性别自动调整的决策规则和临界值，从而为EMS医护人员提供清晰且易于使用的决策支持。

我们的研究表明，在所有年龄组中，女性患者的院前GFAP以及GFAP变化率的最佳临界值都高于男性患者。在未来研究中设定临界值时应考虑这一发现，并需要进一步探讨男女之间ICrhH诱导的GFAP释放差异的原因。未来关于GFAP在卒中诊断中的应用的研究需要对更大的院前样本队列进行高通量检测。这类研究还应进一步探讨如何根据卒中严重程度、样本采集延迟或其他因素对患者进行预筛选，以提高诊断性能。还需要进一步研究ICrhH的类型、位置和病因如何影响GFAP的释放。此外，应通过其他疾病人群（包括肝肾功能不全患者和不同神经系统疾病患者）的随访样本来探讨不同基础疾病状况对基础GFAP水平的影响。

当最终的全血检测方法在足够大的研究队列中应用于救护车上时，应采用高级回归建模来构建诊断方程，以考虑患者的年龄因素，从而更精确地预测ICrhH的排除情况。最后，未来关于院前GFAP在卒中诊断中的应用的研究还应进行决策曲线分析，以提供这一新诊断方法的临床效益的定量估计。

总之，我们的研究表明，基于年龄和性别的分层可以显著提高院前卒中护理中单时间点GFAP检测的准确性，有助于排除ICrhH。我们还复现了之前的发现，证明了从两个连续样本测量院前GFAP变化率所能带来的额外诊断优势。在这个概念验证阶段，我们的发现为指导未来的研究和部署快速高灵敏度GFAP POC仪器提供了依据，以便在实际的院前急救环境中使用。

致谢
作者衷心感谢所在医院区域的所有EMS人员、急诊科护士、神经内科和EMS科室的医生以及临床卒中研究团队的辛勤工作，使该项目得以顺利进行。同时，作者感谢赫尔辛基大学语言中心的Carol Norris对文本的语言编辑工作。