《Journal of Molecular Liquids》：Dual-channel quenching of BSA-AuNCs by sulfamethoxazole: A combined titrimetric fluorescence and blind docking approach
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通过整合光谱滴定、盲分子对接和集合纳米表面能量转移模型，揭示了BSA-AuNC传感器的高灵敏度机制。研究发现双通道NSET框架通过AuNC锚定Cys-34捕获Trp-134和SMZ的能量，使检测灵敏度提升至3.5×104 M-1，并成功解释非零淬灭基线。
Karim M. ElSawy | Said M. Saleh
沙特阿拉伯布赖达卡西姆大学科学学院化学系，邮编51452
摘要
蛋白质-纳米簇杂化荧光传感器的合理设计受到对蛋白质的杂散结合特性如何整合为统一光学信号的机制理解不足的限制。我们通过结合光谱滴定、盲分子对接和基于集合的能量转移模型来研究BSA-磺胺甲噁唑（SMZ）系统，解决了这一问题。荧光淬灭实验表明，BSA-金纳米簇（AuNC）杂化体的灵敏度提高了两倍（KSV = 3.5 × 104 M?1），效率也更高（87.4%）。盲分子对接揭示了15个结合簇的保守且异质性的结合景观，其预测的结合自由能与实验值相符（例如，–6.0 vs. –6.1 kcal/mol），从而验证了结构模型的准确性。这种增强的响应可以通过双通道纳米表面能量转移（NSET）框架来解释：锚定在Cys-34位置的AuNC作为全局天线，通过长距离（1/d4）途径从Trp残基和结合的SMZ中吸收能量。结合竞争性位点占据率和距离依赖的NSET效率的集合模型能够准确重建滴定曲线（R2 = 0.96），并解释了观察到的非零淬灭现象，将其归因于远端结合位点的效率降低。这项工作确立了BSA-AuNC杂化体作为“空间光学滤波器”的潜力，为设计具有放大报告能力的蛋白质模板纳米传感器提供了预测性蓝图。
引言
从经验观察向理性分子设计的转变是杂化荧光传感器研究的关键前沿。蛋白质稳定的金纳米簇（AuNCs）因其卓越的光稳定性[1]、较大的斯托克斯位移[3]、[4]、[5]以及生物相容性[6]、[7]、[8]而成为主要的报告元件。特别是牛血清白蛋白（BSA）被广泛用作AuNC合成的模板[9]、[10]、[11]、[12]，其中蛋白质骨架不仅指导金属核心的生长，还为分析物相互作用提供了复杂的表面[11]、[13]。然而，BSA是一种强大的载体蛋白，能够运输多种小分子，包括脂肪酸[14]、激素[15]和各种药物[16]。这种杂散的结合能力源于其众多的结合位点和构象灵活性，这常常由于非特异性分析物吸附[17]、[18]、[19]、[20]而掩盖了BSA基杂化传感器中的信号转导机制。尽管应用广泛，但这种结合杂散性如何编码为BSA-AuNC杂化体中的单一宏观荧光信号仍不清楚。
从结构上看，牛血清白蛋白是一种心形球状蛋白（约66.5 kDa），由三个同源结构域（I、II和III）组成，每个结构域又分为两个亚结构域（A和B）。这种架构形成了一个异质性的疏水腔体景观，其中IA亚结构域的Sudlow位点和IIA亚结构域的Site II是药物传输的主要储库[21]。对于杂化传感器设计来说，蛋白质的固有报告元件尤为重要：两个色氨酸残基Trp-134（位于IB亚结构域表面）和Trp-212（位于Site I内部）为蛋白质的微环境提供了局部的内部探针。这些残基在不同亚结构域中的空间分布形成了一个内置的光谱网络，允许监测蛋白质骨架中的构象变化和能量转移事件[22]、[23]。此外，IA亚结构域中Cys-34位置的自由巯基为金纳米簇（AuNC）的生物矿化提供了一个独特的、位点特异性的锚点[10]。通过利用这一精确定义的骨架，可以绘制金属核心与远端结合位点之间的空间关系，将蛋白质从被动载体转变为几何校准的分析天线[24]。然而，这种结构几何如何定量转化为观察到的淬灭响应仍大部分未被探索。
BSA-AuNCs被广泛用于检测如磺胺类污染物，其中污染物通常通过静态淬灭作用来影响荧光[25]、[26]。这些研究通常依赖Stern-Volmer模型来描述荧光淬灭[27]、[28]、[29]。尽管该模型在经验上取得了成功[30]，但它往往将蛋白质视为一个整体受体，假设了一个简化的1:1结合化学计量比，忽略了骨架的结构性异质性[31]。理论上，这些系统中的信号转导由纳米金属表面能量转移（NSET）[32]控制。与传统的F?rster共振能量转移（FRET）[33]不同，NSET遵循1/d4的距离依赖性，因此具有显著更大的淬灭效率距离d0（通常>40 ?）[34]，允许AuNC与远端色氨酸（Trp）残基或结合配体之间的长距离相互作用，从而无法将观察到的淬灭信号归因于特定的结合区域。
虽然三种芳香族氨基酸——色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）都对BSA的光物理性质有贡献，但由于Trp的丰度较高（1–3 mol%）和优于Phe和Tyr的光学性质[35]，Trp是主要的荧光团。与吸收率低且量子产率低的Phe以及经常被肽链相互作用或能量转移至Trp而淬灭的Tyr[36]不同，Trp的吲哚基团在约280 nm处是主要的吸收源，在约350 nm处是主要的发射源[36]。在BSA骨架中，Trp212位于Sudlow的Site I内，这是磺胺类化合物的主要结合口袋[38]，允许直接监测静态淬灭和结合事件[39]。在这种架构中，Trp212作为纳米金属表面能量转移（NSET）到AuNC核心的主要能量供体。由于NSET的作用范围广泛且遵循1/d4的距离依赖性，Trp残基能够检测到蛋白质异质景观中的构象变化和配体相互作用[40]，而简化的1:1化学计量比则无法检测到这些现象。因此，Trp不仅仅是偶然的荧光团，而是连接配体结合和纳米簇最终光学输出的 critical 信号转导器[41]。然而，当前的实验分析尚未阐明多个Trp可及和不可及结合位点的贡献如何通过NSET整合到最终的光学输出中。
在这项研究中，我们研究了磺胺甲噁唑与天然牛血清白蛋白（BSA）以及BSA-金纳米簇（AuNC）杂化系统结合后的荧光淬灭行为。稳态荧光滴定用于量化两种系统中的淬灭效率和结合参数。随后，通过盲分子对接和簇分析来绘制BSA上磺胺甲噁唑的异质结合景观，并识别相对于内在Trp荧光团和AuNC的能量有利结合区域。最后，应用基于集合的纳米表面能量转移（NSET）模型将结合几何与实验观察到的淬灭效率相关联。这些方法共同为解释BSA-AuNC杂化体的增强光学响应提供了机制基础。
实验部分
实验：光谱测量和原位合成
金纳米簇是通过蛋白质模板还原方法原位合成的。简要来说，在37°C下，将5 mL浓度为50 mg/mL的BSA溶液与5 mL浓度为10 mM的HAuCl4水溶液混合，并在剧烈搅拌下进行反应。使用1.0 M NaOH将pH调整至12.0以启动还原反应，反应持续12小时，直到观察到稳定的棕金色荧光[42]、[43]。使用模块化荧光光谱仪进行稳态荧光测量以表征
BSA-AuNCs的合成
高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）成功表征了在牛血清白蛋白（BSA）存在下制备的金纳米簇（BSA-AuNCs），尽管它们的尺寸极小。HRTEM图像显示这些纳米簇是水溶性的且单分散的，表明BSA-AuNCs的合成成功。HRTEM图像见图1A。此外，直方图表明BSA-AuNCs具有很高的单分散性，尺寸范围主要集中在2 nm左右
结论
本研究清晰地建立了BSA的微观结合景观与BSA-AuNC杂化体的宏观分析信号之间的定量联系。通过超越简化的1:1化学计量比模型，我们确定BSA-AuNC探针被磺胺甲噁唑淬灭的过程是由15个不同结合簇之间的竞争性热力学分布所控制的。结合结构对接和双通道NSET物理框架的成功整合
CRediT作者贡献声明
Karim M. ElSawy：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、验证、资源准备、方法论、数据分析、概念化。Sayed M. Saleh：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、验证、方法论、研究、数据分析、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
