利用体内碱基编辑技术校正小鼠泽尔韦格谱系病模型的肝脏病理与过氧化物酶体功能

《Nature Biomedical Engineering》：In vivo base editing rescues liver pathophysiology and peroxisome dysfunction in a mouse model of Zellweger spectrum disorder

本研究针对由PEX1基因p.G843D突变引起的泽尔韦格谱系病(ZSD)，开发了一种腺嘌呤碱基编辑(ABE)策略。研究人员通过AAV9递送ABE8e-V106W，在携带Pex1-p.G844D致病性等位基因的小鼠模型(包括新生鼠和4周龄鼠)的肝脏中实现了高效的基因校正(最高达60%)，成功挽救了肝脏病理、体重下降和过氧化物酶体功能障碍，包括恢复了脂肪酸代谢和胆汁酸合成通路。该工作为开发针对ZSD及其他过氧化物酶体疾病的精准基因治疗奠定了基础。

　　

想象一下，人体细胞中一种名为“过氧化物酶体”的微小细胞器，它就像一个高效的专业化工厂，负责分解极长链脂肪酸、植烷酸等有害物质，并参与胆汁酸合成等重要代谢过程。这个“工厂”的正常运转，依赖于一组名为“过氧化物酶体生物合成蛋白”(PEX蛋白)的“装配工”。当编码这些“装配工”的基因发生突变时，“工厂”的组装和功能就会受损，导致一系列代谢废物在体内堆积，引发一系列严重的健康问题，这就是泽尔韦格谱系病(Zellweger spectrum disorder, ZSD)。ZSD是一种罕见的遗传性代谢疾病，其中PEX1基因的p.G843D突变尤为常见，约占所有ZSD患者等位基因的30%。携带此突变的患者常常饱受进行性肝病（可发展为肝硬化、肝癌）的折磨，同时伴有神经功能退化，严重影响生活质量并缩短寿命。目前，除了对症支持治疗和效果有限的肝移植外，尚无能够根治此病的疗法。那么，能否从根源上“修正”这个错误的基因，从而彻底解决疾病问题呢？近期，一项发表在《Nature Biomedical Engineering》上的研究给出了充满希望的答案。研究人员开发了一种针对PEX1-p.G843D突变的体内腺嘌呤碱基编辑策略，并在ZSD小鼠模型中成功实现了基因校正，显著挽救了肝脏病理和代谢功能，为ZSD的精准基因治疗开辟了新道路。

为了开展这项研究，研究人员综合运用了多项关键技术。他们首先在患者来源的成纤维细胞中设计和测试了靶向PEX1-p.G843D位点的引导RNA和不同版本的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，评估了编辑效率和特异性。接着，他们利用临床自然史研究数据分析了携带PEX1-p.G843D等位基因的ZSD患者的肝脏疾病特征。在体内实验中，研究人员构建了模拟人类疾病的小鼠模型(携带Pex1-p.G844D突变)，并采用两种递送系统：一是利用腺相关病毒9型(AAV9)载体将编码ABE8e-V106W编辑器和引导RNA的基因递送至新生和4周龄小鼠体内；二是使用脂质纳米颗粒(LNP)递送ABE8e-V106W的mRNA和引导RNA。他们通过高通量测序评估了体内基因编辑效率，并运用气相色谱-质谱联用、蛋白质印迹、组织染色(油红O、PAS)、RNA测序以及免疫荧光等多种技术，系统分析了基因编辑在纠正肝脏代谢物谱、恢复过氧化物酶体功能、改善肝脏组织病理和转录组方面的效果。此外，还通过CIRCLE-seq和转录组分析等方法对潜在的脱靶编辑进行了评估。

研究结果

1. PEX1-p.G843D等位基因与ZSD患者肝脏疾病相关

对52名携带PEX1-p.G843D等位基因（纯合或复合杂合）ZSD患者的临床数据分析显示，肝脏功能障碍（包括肝酶升高和肝肿大）甚至严重肝病（包括肝硬化、门静脉高压、肝癌）在该人群中非常普遍。这凸显了针对由该等位基因引起的ZSD肝病开发有效疗法的迫切需求。

2. 开发用于校正患者来源成纤维细胞中PEX1-p.G843D等位基因的碱基编辑策略

研究人员设计了靶向PEX1-p.G843D (c.2528G>A)突变位点的引导RNA，并测试了ABE7.10、ABE8e和ABE8e-V106W三种碱基编辑器。在患者来源的纯合PEX1-p.G843D成纤维细胞中，ABE8e和ABE8e-V106W实现了高达80%的致病等位基因校正效率，而ABE7.10的校正效率为20%。高效编辑伴随着对邻近腺氨酸的旁观者编辑，但预测为同义突变或良性错义突变，且未产生显著的插入/缺失(indel)。

3. 体内腺嘌呤碱基编辑高效校正小鼠Pex1-p.G844D等位基因

研究人员构建了双AAV9载体系统，将编码ABE8e或ABE8e-V106W的基因递送至新生Pex1^G844D/+杂合子小鼠。结果显示，ABE8e-V106W在高达4×10¹¹载体基因组(vg)的剂量下仍安全有效，在肝脏中实现了高达52%的致病等位基因校正，且脱靶编辑水平极低。基于此，选择ABE8e-V106W在纯合子疾病模型中进行表型挽救研究。

4. 在纯合Pex1-p.G844D新生小鼠中进行体内碱基编辑

向新生Pex1^G844D/G844D纯合子小鼠（B6129S6 F₁杂交背景）递送不同剂量(1×10¹⁰至1×10¹¹vg)的AAV9-ABE8e-V106W。所有剂量均被良好耐受，并剂量依赖性地挽救了小鼠的生长迟滞。基因编辑效率在6周时最高剂量组达到约57%，并且在16周时，即使最低剂量组的编辑效率也从29%提升至53%，显示出持续的编辑活性。编辑成功恢复了肝脏过氧化物酶体膜蛋白ABCD3的水平，并剂量和时间依赖性地将血液和肝脏中积累的支链脂肪酸(如植烷酸、降植烷酸)和极长链脂肪酸(如C26:0)水平恢复正常或接近正常。肝脏的组织学分析（油红O染色）也显示肝脏脂质堆积显著减少。

5. ABE8e-V106W治疗的Pex1^G844D/G844D新生小鼠的转录组分析

RNA测序分析表明，碱基编辑治疗能剂量和时间依赖性地使疾病小鼠肝脏的转录组谱恢复正常。在治疗16周后，中高剂量治疗组小鼠肝脏的差异表达基因数量与野生型小鼠相比为零或仅有一个。通路分析显示，与肝损伤、纤维化、肝癌以及脂肪酸ω-氧化等代偿通路相关的基因表达在治疗后均恢复到接近野生型水平。此外，肝脏糖原储存（通过PAS染色评估）也得到恢复。

6. 在4周龄Pex1^G844D/G844D小鼠中的治疗性碱基编辑

研究进一步在4周龄的年轻患病小鼠中测试了治疗潜力。单次注射AAV9-ABE8e-V106W (5×10¹¹vg)同样安全有效，在肝脏实现了约50%的等位基因校正。治疗挽救了小鼠的生长，恢复了肝脏ABCD3蛋白水平，并正常化了血液和肝脏中的支链脂肪酸、极长链脂肪酸水平。特别重要的是，治疗显著降低了在患病小鼠肝脏中积累的有毒C27-胆汁酸中间体(DHCA和THCA)的水平。组织学检查也证实了肝脏脂质和糖原代谢的改善。

7. 脂质纳米颗粒递送ABE mRNA的治疗潜力

作为一种非病毒递送方式，研究人员使用LNP将ABE8e-V106W mRNA和引导RNA递送至4周龄患病小鼠。最高剂量(3 mg/kg)在肝脏实现了27%的等位基因校正，并部分恢复了ABCD3蛋白水平，改善了肝脏脂质堆积和糖原储存，证明了该策略与临床验证的非病毒递送平台的兼容性。

8. 靶向Pex1/PEX1致病性变体的ABE8e-V106W体内外脱靶分析

通过CIRCLE-seq和RNA测序对接受高剂量AAV9-ABE8e-V106W治疗的小鼠肝脏进行分析，仅检测到两个位于基因间区的潜在DNA脱靶位点，编辑效率极低(≤0.35%)，且未随时间增加。转录组范围内的RNA脱靶编辑在6周时有轻微增加，16周时消失。在患者成纤维细胞中进行长期慢病毒表达ABE的分析也显示，在26个预测的脱靶位点中，仅有一个位点检测到低于1%的编辑。这些结果表明该ABE编辑策略具有高度的特异性。

9. 校正患者来源成纤维细胞中的PEX1-p.G843D变异可恢复过氧化物酶体稳态

在患者成纤维细胞中，ABE8e-V106W介导的基因校正(效率>80%)成功恢复了过氧化物酶体的正常组装。免疫荧光显示，在编辑后的细胞中，过氧化物酶体基质蛋白过氧化氢酶(催化酶)与膜蛋白ABCD3共定位，形成清晰的点状结构，而在未编辑的细胞中，过氧化氢酶弥散在细胞质中。利用携带过氧化物酶体靶向信号1(PTS1)的GFP报告系统的活细胞成像也证实，编辑恢复了蛋白质向过氧化物酶体的正常导入。

研究结论与意义

本研究成功开发并验证了一种针对常见PEX1-p.G843D致病等位基因的体内腺嘌呤碱基编辑治疗策略。该策略在ZSD小鼠模型中，无论是新生期还是疾病已有所进展的幼年期进行治疗，均能实现高效的基因校正，并随之带来多层次的表型挽救：从恢复过氧化物酶体生发和功能标志物ABCD3，到纠正异常的支链脂肪酸、极长链脂肪酸和胆汁酸中间体代谢，再到改善肝脏脂肪变性、糖原代谢和组织病理，最终使肝脏转录组谱恢复正常并促进生长。值得注意的是，研究还展示了该策略与AAV和LNP两种递送平台的兼容性，为未来临床转化提供了灵活性。

这项工作的重要意义在于，它首次证明了一种精准的基因编辑方法能够直接修正ZSD的遗传根源，并在动物模型中全面挽救其肝脏表型。鉴于ZSD目前缺乏根治手段，以及新生儿筛查使得早期诊断成为可能，本研究为开发能够预防或逆转该病灾难性后果的基因疗法奠定了坚实的基础。尽管针对神经系统症状的全身性治疗仍需进一步优化（本研究中间接观察到大脑中支链脂肪酸水平有所改善），但成功解决主导性的、危及生命的肝脏疾病本身已是一大突破。更广泛地看，这项研究也为利用碱基编辑技术治疗其他由点突变引起的过氧化物酶体疾病乃至更广泛的遗传代谢病提供了概念验证和策略参考。