《Poultry Science》：Development of multiplex real-time RT?PCR assays for the simultaneous detection and lineage differentiation of H9 avian influenza viruses
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本研究针对H9亚型禽流感病毒（AIV）持续造成经济损失及新谱系引入风险，开发了一种可同时检测H9基因并区分Y、B谱系的多重实时逆转录PCR（rRT?PCR）方法。该方法使用一套通用引物及H9通用探针、B和Y谱系特异性探针，在参考株、野外样本及合成的G谱系基因测试中展现出高分析特异性与灵敏度。该工具为H9 AIV的大规模监测和新兴变异株的早期识别提供了敏感、特异且经济高效的技术支持。
禽流感是长期困扰全球家禽养殖业和公共卫生安全的一大挑战。在众多亚型中，H9亚型禽流感病毒（AIV）虽属于低致病性病毒，却可通过导致产蛋量下降以及与其它病原体共感染引起死亡，对家禽业造成持续的经济损失。更值得警惕的是，H9N2病毒是部分高致病性禽流感病毒（HPAI）的内部基因供体，且有通过直接接触感染家禽而传染给人的病例报告。随着病毒在野生鸟类和家禽中广泛传播与演化，H9基因已分化出众多谱系，不同谱系具有独特的流行病学特征、传播动态和地理分布。然而，现有的多数诊断方法仅能进行亚型检测，无法快速区分谱系，这限制了对新引入变异株的早期发现，削弱了监测系统的效能。尤其是在韩国，Y9谱系曾长期流行，B4.6谱系自2020年起成为优势流行谱系，而Y3、Y8谱系在野鸟中持续存在，加之G谱系病毒在多个国家流行，存在通过人类活动引入的风险。因此，开发一种既能灵敏检测又能快速区分病毒谱系的工具，对于有效监测H9 AIV的演化、追踪病毒来源和及时预警至关重要。为应对这一挑战，一项发表在《Poultry Science》上的研究，成功开发并评估了一种新型的多重实时逆转录PCR（rRT?PCR）检测方法。
研究采用了几项关键技术方法。首先，研究人员从GISAID数据库收集了H9基因参考序列及近年报告序列，利用生物信息学软件进行多序列比对和分析，设计了可扩增所有H9谱系保守区域的通用引物，以及一个通用探针（H9-Probe）和两个分别针对B、Y谱系的特异性探针（B-Probe, Y-Probe）。其次，研究使用了50株AIV参考毒株（H1-H15）、7株韩国分离的H9 AIV以及合成的6个G谱系H9部分基因，用于评估该检测方法的分析特异性。再者，通过将代表性病毒进行10倍系列稀释，评估了检测的分析灵敏度与检出限（LoD）。此外，研究还利用2018-2025年韩国全国监测项目中收集的28份H9阳性野外样本（包括口咽拭子、泄殖腔拭子和粪便样本），比较了该多重方法与商业试剂盒的检测性能。最后，通过将不同滴度的B谱系和Y谱系病毒RNA混合，测试了该方法在混合感染样本中同时检测和区分两个谱系的能力。
设计多重H9 rRT-PCR检测的引物/探针组并进行计算机模拟分析
研究团队通过对大量H9基因序列进行比对，设计了一套适用于所有H9谱系的通用正向与反向引物，以确保对不同靶标具有可比且高效的扩增能力。同时，设计了一个可通用检测所有H9谱系的探针（H9-Probe），以及两个分别针对B谱系和Y谱系的、带有不同荧光标记的特异性探针（B-Probe和Y-Probe）。计算机模拟分析显示，通用引物和H9-Probe与Y、B、G三个谱系的序列匹配率均很高（>96%）。Y-Probe对Y谱系的匹配率为89.3%，与B、G谱系基本不匹配；B-Probe对B谱系的匹配率为88.0%，与Y谱系不匹配，但与约25%的G谱系序列在计算机模拟中显示匹配。
多重H9 rRT-PCR检测的分析特异性、分析灵敏度与检出限
在50株不同亚型AIV参考毒株的测试中，该多重检测方法仅检测出H9 AIV，与其它亚型（H1–H8和H10–H15）无交叉反应，显示出100%的分析特异性。合成的G谱系H9基因仅被H9-Probe检测到，而B-Probe和Y-Probe无信号，这提示该方法也可能用于指示G谱系病毒的存在。在分析灵敏度测试中，针对代表韩国不同流行谱系的五个H9病毒，该方法的H9-Probe和Y-Probe的检出限（LoD）为10–102EID50/0.1 ml，与商业M/H9 rRT?PCR试剂盒相当。然而，B-Probe对B4.6谱系病毒（C479）的LoD为102EID50/0.1 ml，灵敏度比H9-Probe低10倍。所有靶标的扩增均显示出优异的线性（R2> 0.99）和可接受的PCR效率（约80%）。
使用多重H9 rRT-PCR检测和区分野外样本中的Y和B谱系H9基因
在28份先前经鉴定的H9阳性野外样本测试中，该多重方法成功在27份样本中检测出H9基因并正确区分了谱系。2022年和2025年从活禽市场采集的家禽样本均被鉴定为B4.6谱系，但2025年的部分样本显示B-Probe的检测延迟或灵敏度下降，同时商业试剂盒的检测也出现延迟。2018年家禽样本和野鸟样本则被正确鉴定为Y谱系。
评估多重H9 rRT-PCR检测对含有两个混合谱系样本的检测和区分能力
研究测试了该方法对混合了不同比例B谱系（C479）和Y谱系（LBM294, 21H225）病毒RNA样本的检测能力。当两种病毒浓度相当时，检测不受影响。但当一种病毒浓度远高于另一种时，低浓度病毒的检测会出现延迟，这种竞争性抑制现象在B-Probe检测低浓度B谱系病毒时更为明显。H9-Probe的Ct值则倾向于反映样本中高浓度病毒对应的数值，而非总H9基因拷贝数。
综合研究结论与讨论，本研究表明，所开发的多重H9 rRT?PCR检测方法能够同时检测所有H9谱系并有效区分B和Y谱系，具有与商业试剂盒相当的高诊断特异性和灵敏度。该方法的核心优势在于，仅使用一套通用引物结合三个特异性探针，简化了实验流程，降低了成本和优化难度，并最大程度减少了因使用多套引物可能带来的扩增偏倚。尽管G谱系活毒未被评估，但使用合成基因的测试结果提示该方法具备鉴别G谱系的潜力。研究也指出了该方法的局限性：近期流行的B4.6谱系毒株在B-Probe结合区出现单个碱基错配，导致检测灵敏度有所下降，这揭示了RNA病毒持续进化对诊断方法提出的挑战，强调了持续进行序列监测并适时更新引物/探针的必要性。此外，临床验证的样本量相对有限，未来需要在更广泛、更多样化的野外样本中进行评估。总体而言，这项研究为H9禽流感病毒的大规模监测和谱系鉴别提供了一个实用、稳健且经济高效的工具，不仅适用于韩国，也对其他受H9 AIV困扰的国家和地区具有重要的应用价值，有助于提升禽流感疫情的预警能力和防控水平。
