《Postharvest Biology and Technology》：The OTU-family protein SlOTU9 enhances cell wall enzyme abundance and promotes tomato fruit softening
编辑推荐：
番茄果实软化关键调控因子SlOTU9的蛋白稳定性机制研究。SlOTU9通过去泛素化作用稳定细胞壁修饰酶（如SlPL16），加速果实软化并缩短货架期，其功能缺失导致果实更硬。研究揭示了OTU家族蛋白在调控果实质地中的新作用机制。
冯汉倩|谭金娟|陈忠凯|邓志平
浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，中国浙江省杭州市310021
摘要
果实软化是决定番茄保鲜期和品质的关键因素，但其背后的调控机制尚未完全明了。虽然细胞壁修饰酶（CWMEs）的转录调控已经较为清楚，但控制这些酶蛋白含量和周转的机制仍不甚明了。在此研究中，我们发现SlOTU9（一种含有卵巢肿瘤（OTU）结构域的去泛素化酶）是果实软化的关键正向调控因子。SlOTU9在果实成熟过程中表达显著增加，其过表达会加速果实软化并缩短保鲜期，而CRISPR-Cas9敲除实验则使果实更加坚实。定量蛋白质组学分析显示，在SlOTU9过表达的果实中，细胞壁修饰酶（尤其是两种果胶裂解酶PLs）的蛋白水平显著上升，但其mRNA水平并未相应增加。进一步研究表明，SlOTU9与果胶裂解酶SlPL16在细胞壁和质膜上发生物理相互作用。当SlOTU9与SlPL16共表达时，SlPL16的稳定性得到提升。这些发现表明SlOTU9可能是调控果实质地的重要因子，并为延长果实保鲜期提供了新的靶点。
引言
果实软化是番茄成熟过程中的一个特征，它能提升果实风味并促进种子传播。然而，这一自然有利的过程也会带来挑战，因为会缩短保鲜期，并增加果实受到机械损伤和病原体侵袭的风险（Brumos, 2021; Thole et al., 2020; Shi et al., 2023）。因此，要平衡果实品质和采后保鲜期，就需要精确理解调控果实软化的机制。历史上，人们通过研究经典成熟突变体（如ripening inhibitor（rin）（Li et al., 2020; Vrebalov et al., 2002）来延长果实保鲜期。但这些突变体的多效性常常导致果实风味和色素发育受损（Kitagawa et al., 2005），因此亟需寻找更精准的果实硬度调控因子，以实现软化控制的精确性而不影响整体品质（Shi et al., 2023）。番茄软化是一个复杂的、受到严格调控的发育过程，受环境因素和内在信号（如乙烯信号、温度和转录网络）的共同影响（Wang and Seymour, 2022; Wu et al., 2024a, Wu et al., 2024b）。这一过程的核心是植物细胞壁的酶促重塑，细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成。多种细胞壁修饰酶（CWMEs），包括膨胀素（EXPs）、果胶裂解酶（PLs）、聚半乳糖醛酸酶（PGs）和果胶甲基酯酶（PMEs），共同参与这种多糖矩阵的降解（Nie et al., 2022; Powell et al., 2003）。其中，果胶降解起着尤为关键的作用。PMEs通过去甲基化同半乳糖醛酸（HG）来启动这一过程，从而促进后续的PGs或PLs的切割（Shi et al., 2023）。尽管PGs的精确作用机制仍有争议，但PLs越来越被认为是果胶降解和果实软化的主要效应因子（Uluisik and Seymour, 2020; Wang et al., 2018）。特别是SlPL16，已被证明通过影响细胞扩张和排列来调控果实硬度，其沉默可延长果实保鲜期（Ren et al., 2023; Yang et al., 2017）。膨胀素虽然非酶活性，但也能促进基质松弛，可能提高底物的可及性（Powell et al., 2003; Su et al., 2024）。
尽管对这些酶的转录调控已有大量研究，但证据表明，仅靠转录本含量并不能完全解释酶的活性。例如，多种关键细胞壁相关蛋白（包括聚半乳糖醛酸酶的β亚基）的mRNA和蛋白水平存在差异：mRNA水平在成熟过程中下降，而蛋白水平保持稳定（Shi et al., 2023; Zheng et al., 1994）。这些观察结果强调了转录后和翻译后调控层的重要性，但目前对这些机制仍知之甚少。
翻译后修饰（PTMs）提供了一种快速且可逆的方式，用于响应发育或环境信号来调节蛋白质功能。其中，泛素化起着关键作用，它通过26S蛋白酶体标记蛋白质以促进其降解，并影响蛋白质的定位和活性（Xu and Xue, 2019）。泛素化由E1、E2和E3酶组成的级联反应介导（Linden and Callis, 2020）。最近对草莓的泛素组分析显示，CWMEs及相关蛋白（包括CSLC4、GAUT、MPE3和CESA）广泛发生泛素化，这表明蛋白酶体介导的蛋白降解可能是果实软化的一个关键调控点（Wang et al., 2023）。
重要的是，泛素化是可逆的。去泛素化酶（DUBs）可以去除泛素基团，从而挽救目标蛋白免于降解或改变其命运（Luo et al., 2023; Feng et al., 2024）。虽然E3连接酶在植物中含量丰富，但DUBs相对较少，且可能具有更广泛的影响。例如，在拟南芥中，只有约69种DUBs，而E3连接酶超过1400种（Skelly et al., 2022）。这些DUBs属于不同的家族，包括含有卵巢肿瘤（OTU）结构域的家族（Kumar et al., 1993; Majumdar and Nath, 2020）。尽管对植物中OTU DUBs的功能研究尚处于起步阶段，但它们已被证实是调控蛋白质稳定性的关键因子，参与器官大小控制、应激反应和组蛋白修饰等关键发育过程（Keren and Citovsky, 2016; Keren et al., 2020; Radjacommare et al., 2014; Suen et al., 2018; Zang et al., 2020）。然而，这类DUBs是否参与多肉果实成熟和软化的协调过程尚不清楚。
本研究探讨了OTU结构域DUBs在果实软化中的作用。基于最近在草莓果实中发现的大量CWME泛素化现象（Wang et al., 2023）以及OTU在维持蛋白质稳定性中的已知作用，我们假设某些OTU成员可能在番茄中调控CWME的丰度。为此，我们对番茄中的SlOTU家族进行了系统性全基因组分析，并发现SlOTU9因其独特的成熟特异性表达模式而成为主要候选因子。通过功能实验、蛋白质组学和生化分析，我们证实SlOTU9通过稳定关键细胞壁修饰酶来促进果实软化。我们的发现揭示了番茄软化的一个新的调控途径，并指出SlOTU9是调节果实质地的潜在靶点。
植物材料与生长条件
番茄植株（Solanum lycopersicum cv. Ailsa Craig，以下简称AC）在温室中生长，温室温度保持在24±1°C，光照周期为16小时光照/8小时黑暗。植株种植在装有标准泥炭基培养基（Klasmann-Deilmann培养基No. 2）的5升盆中。每隔两天浇水一次，每两周施用一次可溶性NPK肥料。根据果实表面颜色，在不同发育阶段收获果实：成熟绿色（MG）、破壳期（BR）等
通过全基因组分析鉴定与成熟相关的OTU家族蛋白SlOTU9
最近对草莓等果类作物的泛素组分析显示，细胞壁修饰酶广泛发生泛素化，表明去泛素化是果实软化的关键调控点（Wang et al., 2023）。鉴于含有卵巢肿瘤（OTU）结构域的去泛素化酶是植物中蛋白质稳定性的关键调控因子，我们推测某些OTU成员可能参与番茄中的这一过程SlOTU9是番茄果实软化的新型翻译后调控因子
果实软化是一个复杂且精细调控的发育过程，在番茄成熟中起核心作用。这一过程的调控是多方面的，涉及由乙烯等关键激素和转录因子等主调控因子控制的转录网络。然而，越来越清楚的是，仅靠转录变化无法完全解释细胞壁修饰酶（CWMEs）活性的动态变化
结论
在本研究中，我们发现OTU家族蛋白SlOTU9是番茄果实软化的新型正向调控因子。在SlOTU9过表达的植株中，果实软化显著加速，保鲜期缩短；而SlOTU9敲除突变体的果实则表现出更坚实的质地。蛋白质组学分析表明，SlOTU9在翻译后水平发挥作用，它显著增加了关键细胞壁修饰酶（CWMEs）的蛋白含量
CRediT作者贡献声明
邓志平：写作——审稿与编辑、实验设计、概念构思。陈忠凯：实验设计。谭金娟：写作——审稿与编辑、实验设计。冯汉倩：初稿撰写、项目管理、实验设计、概念构思。CRediT作者贡献声明
H.F.和Z.D.提出了研究思路并设计了实验方案。H.F.、Z.D.、J.T.和Z.C.共同完成了实验。H.F.和Z.D.分析了数据。H.F.撰写了手稿，H.F.、Z.D.和J.T.修订了手稿。所有作者均审阅并批准了最终版本。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了
浙江省自然科学基金（项目编号LMS26C020002）和
浙江省农业科学院的资助。
