综述：R-loop介导的表观遗传调控在基因组稳定性维持及疾病发病机制中的作用：一项系统综述

《Epigenetics》：The role of R-loops-mediated epigenetic regulation in genome stability maintenance and disease pathogenesis: a systematic review

本综述遵循PRISMA指南，系统整合了71项研究，阐明R-loop作为转录、染色质调控与基因组维持的关键分子中介，通过阻碍DNMTs、招募TET酶调控DNA甲基化，结合RNA修饰（如m5C/m6A）及组蛋白修饰（PRC1/PRC2、G9a/GLP）影响3D基因组架构，其稳态失衡与神经退行性疾病、癌症及代谢/发育异常的表观遗传改变和基因组不稳定性密切相关，为精准医学提供了潜在方向。

　　

ABSTRACT

本系统综述综合了当前关于R-loop相关过程与表观遗传调控、基因组稳定性及人类疾病关联的证据，整合了DNA/RNA/蛋白质修饰及3D基因组组织的研究结果，并强调了与未来研究相关的关键机制和技术缺口，包括长期转化探索的方向。遵循PRISMA指南（注册号：INPLASY202560055），检索了截至2026年1月18日的PubMed和ScienceDirect数据库。两名独立审稿人通过Rayyan平台进行盲法筛选。从初始检索到的1290篇文章中，71项研究符合纳入标准。使用改良的SYRCLE偏倚风险工具评估方法学严谨性。主题合成将R-loop确定为连接转录、染色质调控和基因组维持的反复出现的中间体；在选定系统中报道了类似反馈的关系。它们通过空间阻碍DNMTs以维持启动子低甲基化，同时招募TET酶进行去甲基化，RNA修饰（如m⁵C/m⁶A）可能调节杂交体稳定性，并在某些情况下影响效应因子招募。R-loop促进组蛋白修饰复合物（PRC1/PRC2、G9a/GLP）的招募，从而影响染色质景观和3D基因组结构——包括在特定背景下与TAD边界绝缘和LLPS相关修复区室的关联。R-loop稳态失调与疾病相关的表观遗传改变和基因组不稳定性相关，具有独特的疾病、位点和细胞状态特异性，其在多种疾病中的环境依赖性作用涉及转录沉默、DNA损伤、复制-转录冲突、修复途径、染色质调控和线粒体基因组维持。将DRIP-seq与表观基因组分析和功能测试相结合有助于绘制环境特异性的关系图谱。

GRAPHICAL ABSTRACT

本图形摘要围绕R-loop分为四个部分：DNA修饰、RNA修饰、蛋白质/组蛋白修饰和3D基因组组织。DNA修饰涵盖启动子和靶基因的DNA甲基化。RNA修饰显示5' UTR、编码区和3' UTR。蛋白质修饰描绘了关键的染色质调节因子。3D基因组组织显示高阶染色质结构。失调的R-loop稳态与神经退行性疾病、癌症和代谢/发育障碍相关。

KEYWORDS

R-loop|表观遗传调控|人类疾病|分子机制

Introduction

表观基因组学旨在阐明基因组的化学修饰和空间构象变化如何在不改变核苷酸序列的情况下调节基因功能和表达。近年来，随着组学和高分辨率空间技术的快速发展，R-loop——一种由新生RNA与其DNA模板杂交形成的三链核酸结构——因其在基因组稳定性和表观遗传调控中的关键作用而受到越来越多的关注。在R-loop中，RNA链与模板DNA链形成杂交双链，置换非模板链并产生独特的单链DNA区域。R-loop最初被认为是转录的被动副产物，目前被视为整合基因和表观遗传基因控制机制的重要分子中介。

新出现的证据表明，R-loop除了在转录、基因组稳定性和DNA修复中的作用外，还对染色质构象改变、DNA甲基化和去甲基化过程以及组蛋白和非组蛋白的各种翻译后修饰产生显著影响。此外，R-loop参与高阶染色质折叠和空间基因组组织，直接介导基因可及性和表达谱的精细调节。R-loop稳态的破坏与包括癌症、神经退行性疾病和发育异常在内的几种主要人类疾病的机制密切相关。这些发现强调了阐明R-loop分子机制对于理解疾病发生和发展的重要性，并可能为干预策略提供依据；然而，目前大多数证据仍处于临床前和环境依赖性阶段，使得直接临床转化尚不成熟。尽管证据不断积累，R-loop在多层级表观基因组中的综合作用仍有待系统阐明。它们在DNA甲基化和去甲基化、RNA修饰（如m⁶A甲基化、假尿苷）以及各种翻译后蛋白质修饰之间的桥梁作用，使其成为遗传和表观遗传网络中潜在的核心调节因子。此外，它们在三维基因组组织、细胞分化和疾病发病机制中的作用不断扩大，为疾病机制提供了新的见解，并且一旦具备具有足够特异性和重现性的稳健标准化R-loop检测方法，可能会为精准医疗工作提供信息。

本综述系统总结了R-loop在表观基因组学领域的最新进展，重点关注其分子起源、调控功能以及与DNA/RNA/蛋白质修饰和空间基因组学的相互作用机制。特别强调其在人类健康和疾病中的潜在作用以及前瞻性应用。预计这一综合将有助于机制研究，并帮助优先考虑长期转化方向。然而，治疗开发需要提高位点和环境特异性，减轻多效性影响，并建立临床上可行的监测R-loop动态的方法。

Method

Study protocol and registration

本系统综述严格遵循系统综述和荟萃分析首选报告项目（PRISMA）指南进行设计和实施。研究方案已在国际注册系统综述和荟萃分析方案平台（INPLASY）正式注册，分配注册号INPLASY202560055以及数字对象标识符https://10.37766/inplasy2025.6.0055。注册详情可在INPLASY网站公开获取。

Inclusion and exclusion criteria

符合条件的研究包括调查R-loop诱导的表观遗传修饰及其在人类疾病中的分子机制和病理后果的原创实验研究和高品质组学分析。

Inclusion criteria

研究对象：与人类疾病相关的人类细胞系、组织样本和动物模型，特别关注癌症和神经退行性疾病。

研究内容：明确报告R-loop形成/动态调控与表观遗传改变之间关系的研究，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑。

实验方法：利用DRIP（DNA-RNA免疫沉淀）、ChIP-seq、RNA-seq和全基因组甲基化测序等分子技术，验证R-loop和表观遗传状态。

语言：仅纳入英文出版物。

发表日期：为确保全面检索，未设置时间限制。

Exclusion Criteria

在非疾病、非人类系统中进行的研究、缺乏机制数据的病例报告、综述、评论和纯计算建模研究被排除。

Data sources and search strategy

在PubMed和ScienceDirect数据库中进行了系统检索，检索日期设定为2026年1月18日。检索策略结合了医学主题词（MeSH）和关键词，如“R-loops”、“epigenetic modification”、“DNA methylation”、“histone modification”、“chromatin remodeling”和“human diseases”。详细检索式见附录。

Literature screening and data extraction

在文献筛选过程中，利用Rayyan文献管理平台辅助标题和摘要的初步筛选。两名独立审稿人在Rayyan平台上对所有检索记录进行盲法评估，以提高筛选效率和准确性。符合纳入标准的文章随后进行全文审查和评估。在筛选过程中出现分歧时，通过咨询第三方专家解决未解决的分歧。数据提取采用预先设计的标准化表格，包括基本研究信息、疾病模型类型、R-loop检测和表观遗传修饰方法、关键分子机制、病理影响和核心实验结果。数据提取过程由两名审稿人独立完成，Rayyan平台协助文献管理和跟踪筛选进度，以确保程序标准化和可追溯性。

Quality assessment

使用针对机制性R-loop/表观遗传学研究的改良SYRCLE工具评估偏倚风险，其中随机化/盲法通常报告不完整，且检测有效性可能是推断的主要决定因素。每项纳入的研究在10个预设领域进行评估：（1）序列生成（随机化），（2）分配隐藏，（3）实施盲法，（4）结果评估盲法，（5）数据完整性/完整性，（6）选择性报告，（7）实验可重复性，（8）抗体/试剂特异性，（9）模型/样本确认，以及（10）统计方法（补充表S2）。根据预定义阈值对每项研究的总体偏倚风险进行分类：如果适用项目中>70%被评为低风险则为低风险，如果适用项目中>30%被评为高风险则为高风险，否则为不明确风险。两名审稿人独立评估偏倚风险；分歧通过讨论解决，必要时由第三名审稿人裁决。

Data synthesis

鉴于研究设计和结果的异质性，本综述采用定性描述和主题合成相结合的方法来总结R-loop介导的表观遗传重塑的分子机制及其病理后果。为避免过度解释关联数据集，我们额外标注了3D基因组/LLPS相关陈述的推断强度：（i）相关性共定位，（ii）功能扰动，或（iii）机制/因果证据（重组和/或扰动-拯救与直接读数）。

Result

初始文献检索从PubMed和ScienceDirect数据库识别出1290篇潜在相关文章，其中782篇来自PubMed，508篇来自ScienceDirect。去除重复项并审查标题和摘要后，排除明显不符合纳入标准的出版物，保留298篇文章进行全文评估。最后，应用预定义的纳入和排除标准，71项研究被认为符合条件并被纳入作为本系统综述的分析数据集。完整的文献选择过程如图1所示。

Risk of bias across included studies

使用针对机制性R-loop/表观遗传学研究定制的基于SYRCLE的工具（10个领域；补充表S2）对所有纳入的研究（n=71；文献检索更新至2026年1月18日）进行偏倚风险评估。最常见的问题是结果评估盲法缺失（高风险：29/71）以及实验模型或生物样本确认/表征不完整（模型/样本确认：高风险20/71；不明确13/71）。关于抗体/试剂特异性的不确定性以及对R-loop检测的正交验证报告有限也很常见（不明确：14/71）。11/71的研究被判定为选择性报告不明确，最常见的原因是解释“R-loop稳定/增加”时未始终报告关键阴性对照和/或无效发现（例如，在适用情况下，RNase H敏感性、相互扰动或互补验证的文件不完整）。相比之下，数据完整性始终为低风险（71/71），相对较少的研究在统计方法（4/71）或实验可重复性（不明确4/71；高风险1/71）方面被判定为不明确。完整的研究水平评级和操作决策规则见补充表S2。

RQ1: How do R-loops and epigenetic chemical modifications (e.g., DNA methylation, RNA modifications, histone modifications) influence each other in a locus- and context-dependent manner, and what evidence supports mechanistic coupling relevant to gene expression and genome stability?

Interaction mechanisms between R-loops and DNA methylation, hydroxymethylation, and demethylation.

Mechanistic and correlative links between R-loops and DNA methylation dynamics at selected loci

尽管多项研究证明了R-loop与DNA甲基化模式之间的空间相关性，但直接机制证据仍局限于少数位点，如SEMA3F和TCF21。据报道，R-loop通过物理阻碍和酶招募双重途径与DNA甲基化动态相关。作为空间屏障，R-loop阻碍DNMT1/DNMT3b与SEMA3F和SNRPN等基因启动子区域的结合，从而维持CpG岛低甲基化以促进转录激活。同时，R-loop可能通过GADD45A或DHX33促进TET1/3招募到DSP和TCF21等位点，催化5mC氧化为5hmC以促进主动去甲基化。此外，最近的证据将主动去甲基化机制更直接地与RNA生物学和RNA:DNA杂交体联系起来，支持TET相关去甲基化途径与R-loop环境之间的机制耦合。R-loop调节DNA甲基化状态的这两种机制总结于图2。产生的5hmC增强DNA呼吸动力学，降低DNA双螺旋的稳定性，显著提高模板链与新生RNA之间的退火效率，从而促进R-loop形成。在特定实验系统中，这些观察结果被解释为局部5hmC积累与R-loop倾向之间潜在的相互增强，其中R-loop有利于5hmC生成，而5hmC可能反过来促进杂交体形成。然而，跨位点普遍存在正反馈回路的直接证据仍然有限，互惠程度可能取决于染色质环境以及相关甲基化、去甲基化和杂交体解析因子的可用性。

Potential influence of DNA methylation status on R-loops stability

DNA甲基化和羟甲基化通过结构重塑反向调节R-loop稳定性：CpG甲基化（5mC）诱导Z型DNA-RNA杂交体形成，通过缩小小沟和减少螺旋直径阻碍DNA聚合酶结合，最终导致复制叉停滞。相反，TET酶介导的5hmC降低DNA双链稳定性，显著提高模板链与新生RNA之间的退火效率，从而促进R-loop在转录终止位点富集，并调节胚胎干细胞中与分化相关的途径，如mTOR。DNMT/TET活性和杂交体稳态的扰动已被证明在环境依赖的情况下与疾病相关的表观遗传状态和基因组不稳定性有关：在前列腺癌中，据报道，R-loop – m⁶A – IGF2BPs轴通过阻断DNMT1与肿瘤抑制基因相关。而TET2/3的缺失导致5hmC耗竭，导致R-loop和G-四链体（G4s）异常积累，并与淋巴瘤相关表型有关。这些发现共同支持了一种双向关联，而非普遍存在的因果机制。

RNA chemical modifications tune R-loops stability: potential links to genome topology and drug response.

新兴研究揭示了RNA修饰与R-loop稳定性之间的相关性和机制性相互作用。现有证据表明，RNA表观遗传标记可以根据位点、细胞状态以及所涉及的特定阅读器/效应蛋白，以相反的方向调节R-loop稳定性（图3）：稳定效应：NSUN2介导的m⁵C修饰与增强的R-loop稳定性相关，并直接对抗RNase H1对其的降解，从而延长R-loop的半衰期。这随后将EZH2招募到包括PRDM11在内的肿瘤抑制基因位点，催化H3K27me3的沉积并促进表观遗传沉默。同样，METTL3介导的TERRA m⁶A修饰通过招募hnRNPA2B1蛋白促进端粒区域R-loop的形成和稳定。清除途径的促进：YTHDF2识别m⁶A修饰的R-loop并与RNaseH1协作降解它们，其缺失导致DNA损伤反应失败。TET1介导的m⁵C去甲基化降低R-loop亲和力，促进其在DNA修复后期的有序解离。

这种平衡在特定模型中已被提出，但其普遍性仍不清楚。

在DNA损伤修复的早期阶段，TRDMT1沉积m⁵C以增强RAD52与R-loop的结合亲和力；而在后期，TET1擦除m⁵C以促进其解析，这表明在不同修复阶段可能有不同的RNA修饰酶发挥作用。然而，关于可推广回路的证据有限，疾病相关性目前主要在临床前、环境特异性系统中得到支持。在胶质母细胞瘤中，m⁶A修饰的circPOLR2B核输出减少导致核内R-loop形成增加，从而减轻宿主基因POLR2B的转录抑制并激活下游致癌PBX1信号通路。在膀胱癌患者中，NSUN2过表达与R-loop积累呈正相关。几项研究提供了临床前概念验证，表明扰动RNA修饰酶可以以环境依赖的方式改变R-loop稳态。例如，在HCMV感染模型中，据报道METTL3抑制剂STM2457可减少m⁶A相关的异常R-loop积累。然而，考虑到METTL3在RNA代谢中的广泛作用，疾病相关表型是否通过R-loop调节特异性介导仍不确定。同样，在膀胱癌模型中，NSUN2抑制（如siRNA）与改变的R-loop稳定性和增加的顺铂敏感性相关，但需要进一步的工作来区分直接的R-loop依赖机制与多效性转录效应。我们仅在杂交体扰动/拯救将RNA标记与表型联系起来的情况下，才将R-loop称为可能的机制中介；否则，RNA修饰可能通过转录加工间接影响杂交体。单独的CRISPR是不够的；需要添加直接的R-loop读数和RNaseH1拯救（催化对照）。未来的研究还应解决空间特异性悖论——为什么相同的m⁶A标记可能通过hnRNPA2B1稳定端粒R-loop，同时通过ARID1A依赖性方式促进启动子处的清除。最后，尽管单细胞测序强调了肿瘤亚型对特定RNA修饰途径的依赖（如胶质瘤干细胞中的METTL8–m³C），但将这些观察结果转化为患者分层仍是一个长期目标；目前，缺乏标准化、高特异性且临床可扩展的R-loop检测方法，加上不完全的因果归因，使得临床实施尚不成熟。进展将需要检测协调、正交验证和前瞻性队列研究。总体而言，RNA化学修饰可能通过动态调节R-loop稳定性影响基因组结构重塑，但它们对肿瘤表观遗传失调的贡献可能是位点和环境依赖性的。

Multi-level post-translational modification crosstalk in R-loops – prone contexts and genome homeostasis.

R-loops regulate histone modifications by remodeling the local chromatin environment

R-loop的RNA – DNA杂交结构可以作为潜在的结合平台，促进表观遗传复合物在特定基因组位点的招募或稳定。例如，在基因终止区域，如β-肌动蛋白位点，R-loop形成可促进下游反义转录，导致双链RNA的产生。该dsRNA可招募RNA干扰途径的成分，包括Dicer和Argonaute 2（Ago2），以及组蛋白甲基转移酶G9a/GLP复合物。G9a/GLP复合物催化组蛋白H3赖氨酸9二甲基化（H3K9me2）的沉积，并招募异染色质蛋白1 gamma（HP1γ），形成抑制性染色质结构域。该过程与RNA聚合酶II暂停相关，并参与转录终止的调节。这一将R-loop通过组蛋白甲基化与染色质压缩联系起来的机制途径，在图4中直观总结。在PRC调控的基因，包括HOX簇等发育位点，R-loop积累与RING1B的染色质滞留增加以及部分位点的H2AK119ub1/H3K27me3相关；这是否反映了直接的级联反应是环境依赖性的。在这些系统中，Polycomb标记的状态与目标基因的转录沉默一致。然而，它们在多大程度上反映了一个统一的、杂交体驱动的招募级联与平行的染色质特征可能因位点而异，仍有待阐明。在核仁区域，SETX缺乏等病理条件导致R-loop异常积累，显著降低H3K9ac/H4K16ac水平，破坏开放染色质结构，干扰rRNA加工，并最终触发核仁功能障碍。

Ubiquitination pathways linking R-loop – prone contexts to DNA repair factor stability and localization

多项研究表明，泛素化和去泛素化可以影响R-loop易发环境中DNA修复因子的稳定性、活性和定位。尽管这些事件通常在独立的实验系统中被表征，并且可能不构成单一的分层途径，但它们共同表明杂交体相关的转录/复制应激与修复能力之间存在调节联系。修复因子稳定性的调节：USP11抵消KEAP1介导的SETX K48连接的多泛素化，从而稳定SETX并保留其解析R-loop的能力。同样，TOP3B的稳定性通过降解和去泛素化之间的平衡来维持：MIB1促进TOP3B K11/K48连接的泛素化和蛋白酶体周转，而TDRD3–USP9X复合物去除这些泛素链以稳定TOP3B。这种动态平衡防止有毒的TOP3B切割复合物积累并保护R-loop稳态。

修复因子定位和功能的调节：泛素化还决定了修复因子的空间部署。RNF8介导的XRN2泛素化促进其招募到R-loop易发区域，如转录终止位点，实现高效的R-loop解析。在复制应激下，RAD18催化PCNA在K164的单泛素化，促进Fanconi贫血核心蛋白FANCD2招募到停滞的复制叉并增强同源重组修复。

染色质环境和环境调节：除了单个蛋白质，泛素信号传导还调节R-loop周围的染色质环境。Mdm2和RNF2催化组蛋白H2A在赖氨酸119（H2AK119ub）的单泛素化，加强抑制性染色质状态，限制异常的转录-复制冲突。H2AK119ub水平降低与R-loop积累和复制叉功能障碍相关。总的来说，这些发现支持泛素信号传导可以在RNA:DNA杂交体积累的环境中调节修复因子的部署和局部染色质环境。这些泛素依赖的过程在多大程度上在不同环境中形成一个协调的网络仍有待确定。

Crosstalk between R-loops and phosphorylation, acetylation, ADP-ribosylation, and phase separation in genome stability contexts

各项研究表明，磷酸化、乙酰化、ADP-核糖基化和相分离与R-loop形成或解析相关，提示存在多个串扰点。然而，这些联系的指向性和整合是环境依赖性的，尚不支持单一的调节网络。具体而言，RNA聚合酶II羧基末端结构域（CTD）的Ser2/Ser5磷酸化调节转录延伸效率，从而间接影响R-loop形成倾向。乙酰化修饰表现出双重调节作用——SIRT7催化的DDX21去乙酰化增强R-loop清除能力，而HDAC抑制剂诱导的组蛋白H3K9ac过度升高导致染色质结构改变并增加R-loop积累的风险。在DNA损伤反应水平：在SRSF2突变条件下，R-loop激活PARP1催化的PARylation修饰，招募RNase H1/H2启动修复。相反，HMGA1的ADP-核糖基化通过NUDT16驱动的逆转修饰维持复制叉稳定性，独立介导化疗耐药性。高阶调节通过相分离实现，其中端粒重复序列包含RNA（TERRA）通过其G-四链体结构与LSD1形成液-液相分离凝聚物，促进局部R-loop形成。

The pivotal role of R-loops in 3D genome remodeling: from spatial barriers to epigenetic memory programming

R-loop-mediated remodeling of 3D genome spatial architecture

在特定背景下，R-loop与高阶染色质组织的改变有关，证据范围从位点水平的机制研究（包括重组）到与3D基因组特征的更广泛的相关性重叠（图5）。R-loop和黏连蛋白介导的环挤压经常在边界样区域相遇。基于这种共定位，有人提出杂交体的空间或拓扑效应可能阻碍环挤压，从而在特定设置中帮助定义TAD边界。与这一模型一致，单分子重组显示RNA:DNA杂交体可以直接在体外停滞黏连蛋白介导的DNA压缩：黏连蛋白在与R-loop第一次碰撞后约19±8 kb处停滞，平均需要约5±2次碰撞才能完全停止。相比之下，R-loop图谱与绝缘/TAD特征的基因组范围重叠