《TRENDS IN FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY》：Fungal cell factories: advancing the field of cellular agriculture
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本篇综述系统性地梳理了真菌细胞工厂在细胞农业领域的多样化应用。文章重点阐述了如何利用酵母和丝状真菌等微生物，通过精密发酵（Precision fermentation）等技术生产蛋白质、脂质等传统上来源于动物的食物成分，并将其用于肉类、乳制品和蛋类替代品。综述还探讨了真菌固有的生物学特性（如营养灵活性、高分泌能力）如何使其成为理想的细胞工厂，并介绍了相关的基因工程工具（如CRISPR-Cas9）和菌株优化策略（如糖基化工程）。这些进展为开发可持续、可扩展的动物产品替代方案提供了关键技术支持，有望应对传统畜牧业带来的环境与公共卫生挑战。
真菌：细胞农业中的全能工厂
想象一下，未来的汉堡、奶酪和鸡蛋并非来自农场，而是诞生于洁净的发酵罐中。这并非科幻，而是细胞农业（Cellular agriculture）——一个旨在通过细胞培养而非饲养整只动物来生产肉、奶、蛋等动物产品的新兴领域。在这场食品革命中，一个看似不起眼的生物类群正扮演着越来越关键的角色：真菌。从我们熟悉的面包酵母到制造酱油的米曲霉，这些微生物正被改造成高效的“细胞工厂”，为我们的餐桌提供可持续的新选择。
为何选择真菌？
真菌王国种类繁多，从微小的酵母到庞大的蘑菇，它们展现出惊人的遗传、形态和生理可塑性。许多真菌能在极端环境中生存，这种与生俱来的强韧性和代谢可塑性，使其非常适合用于生物制造。更重要的是，真菌在食品生产领域早有“案底”：它们被长期用于酒精发酵、有机酸生产以及食品加工酶（如淀粉酶、纤维素酶）的制造。这种“食品安全”的历史记录，结合其易于遗传操作的特点，让真菌成为细胞农业领域极具潜力的工具。
真菌的 versatility 还体现在其“不挑食”上。许多环境真菌是腐生生物，以腐烂的有机物为食，因此进化出了大量降解生物质的酶和通路。这种营养灵活性使它们能够高效利用各种工农业废料作为低成本原料，例如乳制品废水、木质纤维素材料、水果加工废料等，将废弃物转化为微生物油脂、乙醇、有机酸和富含蛋白质的生物质。这不仅能创造经济价值，还能减轻环境处理负担，完美契合循环生物经济的原则。
强大的基因工具箱
要将真菌打造成高效的细胞工厂，离不开精密的遗传操作工具。早期的质粒系统常面临拷贝数低、不稳定的问题。如今，染色体整合已成为构建基因稳定工程菌株的首选策略。真菌天生倾向于进行同源重组（HR），这大大方便了外源基因的整合。近年来，CRISPR-Cas9技术的引入彻底改变了游戏规则。它允许在特定位点引入DNA双链断裂，当与破坏非同源末端连接（NHEJ）DNA修复途径（许多真菌的首选修复方式）相结合时，能极大提高同源定向修复（HDR）的效率，在某些真菌中报道的HDR效率高达80%到98%。
除了高效的基因编辑工具，真菌细胞工厂还受益于成熟的转录控制系统，包括许多特性明确的启动子。例如，丝状真菌黑曲霉（Aspergillus niger）的葡糖淀粉酶A（PglaA）启动子和毕赤酵母（Pichia pastoris）的醇氧化酶1（Paox1）启动子都是强诱导型启动子，已被用于实现克每升级别的蛋白质表达。此外，像甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（PgpdA）这样的强组成型启动子，也能在优化培养条件下驱动可与强诱导型启动子相媲美的蛋白表达。这些工具共同为在真菌中高效、可控地生产目标产物奠定了基础。
蛋白质的精密发酵生产
精密发酵是细胞农业的核心技术之一，它涉及对微生物进行基因工程改造，以生产特定的、高价值的生物分子，如蛋白质。真菌在这方面表现出众，主要归功于其强大的蛋白质分泌能力。
用于工业规模蛋白质生产的主要是真菌两大类群：酵母和丝状真菌。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在重组蛋白生产方面历史悠久，其多种产品已获得“公认安全”（GRAS）地位。毕赤酵母则以发酵周期短（3-6天）、能达到高细胞密度（高达150 g/L）而闻名。丝状真菌，如曲霉属（Aspergillus）和里氏木霉（Trichoderma reesei），则因其分泌大量水解酶（如淀粉酶、纤维素酶）的天然能力而备受推崇。目前报道的最高蛋白质滴度——100 g/L，就是通过里氏木霉发酵实现的。值得一提的是，精密发酵初创公司Perfect Day正是利用工程化的里氏木霉来生产重组β-乳球蛋白，这是其“无动物”乳制品的关键成分。
蛋白质在真菌细胞内的“旅程”大致分为三步：1）新生多肽从核糖体转移至内质网（ER）；2）在内质网中进行蛋白质折叠和翻译后修饰；3）蛋白质通过囊泡运输至高尔基体，最终分泌到细胞外环境。这个过程中涉及信号肽识别、分子伴侣辅助折叠、糖基化修饰以及囊泡运输等多个精细环节。为了提高目标蛋白的产量，科学家们发展出了一系列菌株工程策略：
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密码子优化与内含子介导的增强：通过将目的基因中的稀有密码子替换为宿主偏爱的同义密码子，可以提高表达水平、mRNA稳定性和翻译效率。有时，在基因中插入特定的内含子序列也能显著增强基因表达，这种现象被称为内含子介导的增强（IME）。
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信号肽与载体蛋白工程：利用来自宿主自身高分泌蛋白的信号肽，可以有效引导异源蛋白的分泌。此外，将目标蛋白与一个天然的、易于分泌的“载体蛋白”融合，也能提高其稳定性和分泌效率。
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胞内运输优化：通过过表达参与囊泡组装和运输的因子（如SEC16），或敲除某些导致蛋白在内质网滞留的凝集素型货物受体，可以改善蛋白质从内质网到高尔基体再到细胞外的运输效率。
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未折叠蛋白反应（UPR）和内质网相关降解（ERAD）调控：过量生产重组蛋白可能导致内质网应激。通过过表达UPR关键转录因子（如HAC1）或分子伴侣（如BiP），可以帮助蛋白正确折叠，缓解应激，从而提高产量。相反，调控ERAD途径可以减少目标蛋白的降解。
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糖基化工程：糖基化是真菌分泌蛋白最常见的翻译后修饰。但过度糖基化（尤其是甘露糖添加）可能影响异源蛋白功能。通过敲除特定的甘露糖基转移酶基因（如MNN9, OCH1），可以减少过度糖基化，提高蛋白产量和活性。此外，为了生产更接近哺乳动物来源的糖蛋白（如某些药用蛋白），科学家还开发了“人源化”糖基化真菌菌株，例如毕赤酵母的GlycoSwitch技术。
真菌生产的细胞农业用蛋白
真菌细胞工厂已经在细胞农业领域展现了其实用性和多样性，生产了用于增强风味、改善质地和增加食品营养价值的各种蛋白质。
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支持培育肉和肉类替代品：培育肉（又称细胞培养肉）生产的一大成本驱动因素是蛋白生长因子，如成纤维细胞生长因子2（FGF2）。毕赤酵母已被用于生产人胰岛素样生长因子1（IGF-1），产量可达0.5-1 g/L，为细胞培养提供了经济高效的生长因子来源。此外，真菌还被用于生产改善肉类替代品感官特性的蛋白。例如，Impossible Foods使用工程化毕赤酵母生产大豆豆血红蛋白（LegH），作为其植物肉饼的颜色和风味添加剂。Motif FoodWorks也使用毕赤酵母生产重组肌红蛋白（HEMAMI），以模拟传统肉类的颜色和风味。
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奶类和蛋类替代品：乳制品蛋白（如β-乳球蛋白、酪蛋白）和蛋类蛋白（如卵清蛋白）因其独特的功能特性（如凝胶、发泡、乳化）而难以被替代。真菌细胞工厂在此取得了突破性进展。Perfect Day利用里氏木霉生产牛β-乳球蛋白，并已成功商业化，用于冰淇淋、奶油奶酪等产品。多家公司也正在利用毕赤酵母等真菌生产重组酪蛋白，用于制造无动物奶酪。在蛋类替代方面，里氏木霉和毕赤酵母都被用于高效生产卵清蛋白。例如，Onego Bio使用里氏木霉生产的Bioalbumen（卵清蛋白），以及The EVERY Company使用毕赤酵母生产的卵清蛋白，均已成功应用于糖果、蛋白饮料和烘焙食品中。
产油酵母的脂质生产
除了蛋白质，脂质（脂肪）也是动物产品风味和营养的关键组成部分。一些被称为“产油酵母”的真菌，如解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、圆红冬孢酵母（Rhodotorula toruloides）和高山被孢霉（Mortierella alpina），能够积累大量细胞内油脂，含量可超过其细胞干重的80%。它们主要通过两条途径积累脂质：
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从头合成：当培养基中亲水碳源（如葡萄糖、甘油）丰富但必需营养（通常是氮）受限时，酵母会将多余的碳通量转化为脂质，主要以三酰甘油（TAG）的形式储存在脂滴中。这条途径通常能获得较高的TAG产量。
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外源合成：一些酵母能够直接利用和转化疏水碳源（如油、烷烃）。它们摄取游离脂肪酸或将其从甘油三酯中水解出来，然后将其并入自身的TAG分子中。这条途径的优势在于可以利用废弃食用油等低成本原料。
为了提高脂质产量和定制脂质组成，代谢工程策略被广泛应用。例如，通过敲除竞争途径（如过氧化物酶体β-氧化）的基因，可以增加脂质积累。在解脂耶氏酵母中敲除过氧化物酶体生成基因PEX10，使二十碳五烯酸（EPA）产量增加了近一倍。通过表达异源去饱和酶基因，也可以改变脂质的脂肪酸组成。
真菌脂质在细胞农业中的应用
产油酵母已被用于生产多种具有营养价值的脂质。例如，杜邦公司利用工程化解脂耶氏酵母生产富含EPA的油脂，作为鱼油替代品销售。在婴幼儿配方奶粉领域，科学家正尝试利用解脂耶氏酵母模拟人乳的脂肪酸组成，特别是提高棕榈酸在甘油三酯sn-2位上的含量（形成β-棕榈酸），这已被证明有助于婴儿对脂肪酸和钙的吸收。此外，一些初创公司（如Melt&Marble, Nourish Ingredients）正在探索利用工程化酵母生产能够模仿肉类风味和质地的动物脂肪替代品。
真菌在细胞农业中的其他应用
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菌蛋白：菌蛋白指通过受控发酵生产并经过热处理以降低RNA水平的真菌菌丝体。它本身就是一种完整的蛋白质来源，富含纤维且脂肪酸组成健康。最为人知的例子是Quorn Foods使用镰刀菌（Fusarium venenatum）生产的菌蛋白，自上世纪80年代起就被用作肉类替代品。如今，通过CRISPR-Cas9等先进技术对生产菌株进行工程改造，可以进一步提高菌蛋白的产量和营养品质。菌蛋白不仅可作为肉类类似物直接食用，也可作为食品添加剂，用于改善植物基肉替代品的质地和消化率。
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培育肉的可食用支架：要生产具有复杂三维结构的“整块”培育肉产品，需要可食用支架来支持细胞附着生长。真菌产生的几丁质及其衍生物壳聚糖，因其可生物降解和无毒的特性，被认为是潜在的支架材料。更有趣的是，食用真菌（如平菇Pleurotus ostreatus）的整个菌丝体网络，其多孔结构及表面存在的蛋白质和多糖基团，能够支持动物细胞（如成纤维细胞）的附着和生长，有望成为培育肉的天然生物支架。
总结与展望
真菌凭借其卓越的蛋白质分泌能力、强大的脂质积累潜力、丰富的遗传操作工具包以及良好的食品安全记录，已在细胞农业领域确立了其作为“明星细胞工厂”的地位。从无动物奶制品、蛋类到培育肉的风味添加剂，再到可持续的油脂和新型蛋白食材，真菌正在为构建一个更高效、更环保、更健康的未来食品体系提供关键的技术和产品。随着基因合成、遗传工程和组学技术的飞速发展，以及人工智能和机器学习等支持性技术的助力，利用真菌的障碍正在迅速降低。可以预见，真菌细胞工厂将在未来的餐桌上扮演越来越重要的角色，帮助我们以更可持续的方式满足全球不断增长的营养需求。
