《ACS Synthetic Biology》：PHYCUT: Scalable Multiplex CRISPR/Cas9 Editing for Genome Engineering in the Diatom Phaeodactylum tricornutum
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为了解决三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）中缺乏高效多重基因组编辑工具、限制其作为生物制药平台（尤其是重组蛋白糖基化“人源化”）的难题，研究人员开发了名为PHYCUT（Phaeodactylum tricornutumCsy4?Cas9 multiplex tool）的质粒基CRISPR/Cas9系统。该系统利用Csy4内切核糖核酸酶处理多向导RNA阵列，首次实现了对三个负责α(1,3)岩藻糖基化的FucT基因同时敲除，并获得分泌蛋白岩藻糖基化水平显著降低的工程藻株。这项工作为三角褐指藻的N-糖基化通路改造及下一代藻类生物技术奠定了关键基础。
在微藻的世界里，三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）堪称一颗“明星”。它不仅是全球氧气生产的重要贡献者（约占20%），更因其代谢多样性、易于规模化培养以及拥有与人类相似的N-连接糖基化（N-linked glycosylation）核心通路，而被视为生产重组蛋白（如治疗性抗体）极具潜力的合成生物学平台。然而，这条“希望之路”上横亘着一个不小的障碍：三角褐指藻会在其N-糖链的核心位置添加一种α(1,3)连接的岩藻糖（core α(1,3)-linked fucose）。这种糖基修饰在人类中具有潜在的免疫原性，可能引发免疫反应，从而严重限制了基于该藻株生产的生物药物的临床应用前景。
问题的核心在于三角褐指藻基因组中存在三个推测负责此修饰的岩藻糖基转移酶（Fucosyltransferase, FucT）基因。要想实现糖基化通路的“人源化”，降低或消除这种非人源化的岩藻糖修饰，最理想的策略是同时敲除这三个基因。然而，传统的CRISPR/Cas9编辑工具在三角褐指藻中难以实现高效、便捷的多重基因编辑。现有的方法，无论是基于多个独立启动子表达向导RNA（sgRNA），还是DNA-free的核糖核蛋白（RNP）递送，都存在克隆复杂、效率有限或会导致营养缺陷型等局限性。缺乏一个强大、可扩展的多重编辑系统，成为了充分挖掘三角褐指藻生物技术潜力的主要瓶颈。
为了解决这一难题，并推动三角褐指藻迈向下一代生物制药宿主，研究人员在《ACS Synthetic Biology》上发表了他们的研究成果。他们开发了一种名为PHYCUT（Phaeodactylum tricornutumCsy4?Cas9 multiplex tool）的新型、可扩展的多重CRISPR/Cas9编辑系统，并成功利用该系统同步敲除了三个FucT基因，有效降低了分泌蛋白的α(1,3)-岩藻糖基化水平，为最终实现三角褐指藻糖基化通路的完全“人源化”迈出了关键一步。
为了开展这项研究，作者们主要运用了几个关键技术方法：首先，他们构建了PHYCUT质粒系统，该系统将化脓性链球菌Cas9（SpCas9）、来自铜绿假单胞菌的Csy4内切核糖核酸酶以及一个由U6启动子驱动的多向导RNA（sgRNA）阵列整合在同一质粒上，利用Csy4精准加工多顺反子转录本以产生单个有活性的sgRNA。其次，他们优化并采用了两种DNA递送方法——细菌接合（bacterial conjugation）和电穿孔（electroporation）——将PHYCUT构建体转入三角褐指藻，并比较了其编辑效率。再者，他们利用RNA测序（RNAseq）深入分析了三角褐指藻野生型细胞中N-糖基化通路相关基因（特别是三个PtFucT基因）在不同生长时期的表达谱，为靶点选择和后续表型分析提供了依据。此外，研究还建立了一种基于酶联免疫吸附试验（ELISA）的高通量筛选方法，使用特异性识别核心α(1,3)-岩藻糖的抗体，定量检测并比较了野生型与各FucT突变株分泌蛋白中的岩藻糖基化水平变化。
研究结果
Csy4对sgRNA阵列的加工
研究人员通过Northern印迹分析证实，在表达PHYCUT系统的三角褐指藻细胞中，由U6启动子转录出的多向导RNA初级转录本能够被共表达的Csy4蛋白有效加工，产生与预期大小相符的单个sgRNA片段，这为后续的多重编辑功能奠定了基础。
PHYCUT在三角褐指藻中实现多重编辑
以腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APT）基因作为报告基因，研究人员验证了PHYCUT系统的编辑能力。实验发现，即使使用两个靶向同一基因不同位点的sgRNA，敲除效率相较于单个sgRNA并未有统计上的显著提升，但确实观察到了由双sgRNA诱导的、两个靶位点之间的大片段缺失。更重要的是，通过电穿孔递送PHYCUT质粒获得的编辑效率，显著高于通过细菌接合递送的方式。
阵列中向导RNA的顺序影响编辑效率
当使用靶向APT和尿苷酸合成酶（UMPS）两个不同基因的sgRNA构建双基因敲除阵列时，研究人员发现sgRNA在阵列中的线性顺序显著影响其编辑效率。位于阵列前端的sgRNA表现出更高的编辑活性，而后端sgRNA的活性则相对较低，这表明在通过接合递送的条件下，阵列位置而非sgRNA本身的内在活性是造成编辑效率差异的主要因素。
PHYCUT可表达多达六个sgRNA
通过构建包含不同数量非靶向sgRNA的阵列，研究人员测试了PHYCUT系统的多重编辑能力上限。结果表明，当阵列中包含多达四个sgRNA时，对APT基因的敲除效率仍能保持较高水平；当阵列扩展至五个或六个sgRNA时，编辑效率虽有所下降，但仍可被明确检测到。这证明了PHYCUT系统具备进行大规模多重基因组编辑的潜力。
N-连接糖基化通路的RNA测序分析
通过对野生型三角褐指藻进行RNAseq，研究人员绘制了其N-糖基化通路基因的表达谱。特别聚焦于三个PtFucT基因（PtFucT1, PtFucT2, PtFucT3），发现PtFucT1和PtFucT3的表达量相对较高，而PtFucT2的表达量则低得多。系统发育分析还揭示了PtFucT1可能源于节肢动物的水平基因转移事件，而PtFucT2和PtFucT3则属于SAR类群特有的一个进化支。
PHYCUT敲除FucT多基因家族
利用PHYCUT系统表达三个分别靶向PtFucT1、PtFucT2和PtFucT3基因的sgRNA，研究人员成功实现了对这三个基因的同时编辑。在30个初筛的接合子中，有15个在三个靶位点均检测到编辑事件。从显示编辑的接合子中分离亚克隆，进一步获得了在多个FucT位点带有不同编辑类型的突变株系。
FucT敲除株显示分泌蛋白核心α(1,3)-岩藻糖基化水平降低
通过建立的ELISA方法对筛选出的FucT突变株进行表型分析，研究人员发现，与野生型相比，大多数突变株分泌蛋白的核心α(1,3)-岩藻糖基化水平均出现显著下降。其中，由PHYCUT系统编辑获得的突变株，其岩藻糖基化降低程度平均高于由单sgRNA构建体编辑的株系。特别是有四个PHYCUT编辑的突变株（tg5.13, tg21.6, tg21.8, tg21.12）在所有检测时间点均表现出持续且大幅度的岩藻糖基化降低（例如在第8天平均降低约88%），且这些株系的生长未受到明显负面影响。
研究结论与意义
本研究成功开发了PHYCUT——一个用于三角褐指藻的、基于质粒的、可扩展的多重CRISPR/Cas9基因组编辑系统。该系统利用Csy4内切核糖核酸酶处理多向导RNA阵列，能够实现多达六个基因位点的同时编辑。研究首次利用PHYCUT同步敲除了三角褐指藻中三个负责α(1,3)岩藻糖基化的FucT基因，并获得了一系列分泌蛋白岩藻糖基化水平显著降低（最高降幅达90%）的工程藻株，且这些突变株的生长适应性未受损害。
这项工作具有多重重要意义：首先，PHYCUT系统本身填补了三角褐指藻乃至硅藻领域缺乏高效、便捷、可定制化多重基因组编辑工具的空白，其质粒化设计兼容电穿孔和细菌接合等常用递送方式，且编辑后质粒可被轻易消除，便于后续多轮遗传操作。其次，该研究通过对FucT多基因家族的成功编辑，为三角褐指藻N-糖基化通路的“人源化”改造奠定了坚实的基础。降低乃至消除免疫原性的α(1,3)-岩藻糖修饰，是使三角褐指藻成为安全、可靠的重组治疗性蛋白（如单克隆抗体）光合生产平台的关键第一步。最后，PHYCUT系统的建立不仅服务于糖基化工程，其强大的多重编辑能力还可广泛应用于研究三角褐指藻的其他多基因家族功能、敲除竞争性代谢通路、改造宿主以提升目标产物产量等合成生物学和基础生物学研究的诸多方面，从而全面释放这种重要微藻的生物技术潜力。
