《Chemical Research in Toxicology》：A Method to Calibrate Chemical-Agnostic Quantitative Adverse Outcome Pathways on Multiple Chemical Data
编辑推荐：
本研究针对现有定量不良结局通路（qAOP）研究在整合多化学物质数据时，未能充分处理化学物质间异质性、从而影响模型可靠性与普适性的难题，开发了一种基于层次结构、能够系统分离化学特异性异质性与核心通路效应的校准新方法，并通过模拟研究和肝脏肿瘤qAOP案例验证了其有效性，为基于新方法（NAMs）的下一代风险评估提供了更稳健、更具化学无偏性的qAOP模型框架。
在环境健康与毒理学研究领域，科学家们一直在寻找能够预测化学物质暴露如何一步步导致不良健康结局的“路线图”。不良结局通路（Adverse Outcome Pathway, AOP）框架就是这样一种强大的组织工具，它描述了从分子起始事件到细胞、器官乃至个体水平不良结局的连锁生物学事件。而定量AOP（Quantitative AOP, qAOP）则更进一步，旨在建立关键事件（Key Events, KEs）之间以及KEs与不良结局（Adverse Outcomes, AOs）之间的定量关系，从而支持危害识别、基准点（Points of Departure, PODs）推导，最终服务于基于新方法（New Approach Methodologies, NAMs）的下一代风险评估，减少对动物试验的依赖。
然而，理想很丰满，现实却存在一个根本性挑战。AOP/qAOP的一个核心原则是“化学无偏性”，即其描述的生物学通路机制应独立于触发它的特定化学物质。只要分子起始事件被足够强度地触发，无论何种化学物质，下游的关键事件链都应能被激活。这与依赖于特定化学物质暴露及其剂量-反应关系的“作用模式”（Mechanisms of Action, MOAs）有本质区别。不幸的是，现有的许多qAOP研究在实践中对“化学无偏性”原则的遵循有限。一些研究仅使用单一化学物质的数据构建模型，其普适性存疑；另一些研究虽然使用了多化学物质数据集，却未能妥善处理化学物质间的异质性。这种异质性可能源于化学结构和性质的差异，导致不同化学物质触发上游关键事件所需的效力存在巨大差异。当这种异质性显著时，如果不加区分地将数据合并建模，化学特异性的变异会掩盖真正的通路水平效应，导致模型不可靠且难以推广到新的化学物质。因此，如何从混杂的数据中提炼出真正“化学无偏”的核心通路关系，成为qAOP发展和应用中的关键瓶颈。
为此，发表在《Chemical Research in Toxicology》上的这项研究，旨在开发一个校准框架，以建立真正化学无偏的qAOP模型。研究团队提出了一种创新的校准方法，利用统计学中的层次结构（分层模型）来系统地区分化学特异性异质性与底层的化学无偏通路效应。简单来说，他们将化学特异性偏差明确定义为随机效应进行建模，从而能够提取出代表核心机制关系、独立于个体化学性质的“通路水平”参数。这就像是从一群各有特色的歌手中，分离出每个人独特的嗓音（化学特异性偏差），从而清晰地识别出那首所有人共同演唱的旋律（核心通路关系）。
为了验证这一方法，研究人员首先进行了一项模拟研究。他们生成了具有不同水平化学间异质性（从无到高）的数据集，然后分别用普通（“扁平”）模型和带有层次校准的模型进行拟合比较。结果明确显示，随着数据异质性水平的提高，层次模型的预测性能优势越来越明显。当异质性达到中等或更高水平时，扁平模型因混淆了通路效应与化学特异性变异，其性能显著下降。这表明，层次校准能有效揭示数据中异质性的大小，并且在异质性显著时不可或缺。
随后，研究者将这一校准方法应用于一个真实案例：研究由持续肝细胞增殖诱导的非诱变性肝肿瘤的qAOP。他们使用了来自10种化学物质（11项研究）的啮齿动物实验数据，其中上游关键事件（KEup）是肝细胞增殖标志物BrdU阳性细胞百分比，下游关键事件（KEdown）是肝肿瘤发生率。数据分析显示，这些数据中存在小到中等程度的化学间异质性。应用层次校准框架后，层次化qAOP模型在预测性能上显著优于扁平模型。更重要的是，层次模型能够提供更准确的不确定性估计（其95%后验预测区间能更好地覆盖数据点），并且基于该模型推导出的、对应于肿瘤发生率额外增加5%的BrdU基准水平（Benchmark Level, BML），其均值与下限的比值更小，表明其评估结果更为稳健和可靠。这项案例研究证实，对于存在显著异质性的数据，忽略层次校准的扁平模型无法被视为真正的化学无偏模型，而本研究提出的方法则能有效地识别和表征这种异质性，从而得到更可靠的qAOP。
关键技术方法
本研究主要采用了基于贝叶斯统计的层次建模（分层模型）框架。具体技术方法包括：1. 定量AOP模型构建：采用基准剂量（BMD）方法论，分别用连续Hill函数和重参数化的二分Hill函数对剂量-反应（上游KE）和反应-反应（上、下游KE之间）关系进行建模。2. 层次结构引入：在反应-反应模型部分，将最大概率（v）、背景风险比（q）和效力（h）三个参数设定为化学特异性（随机效应），而形状参数（r）设定为化学无偏（固定效应），并通过多元正态分布刻画化学特异性参数间的相关性。3. 模型拟合与评估：使用Stan软件平台通过哈密顿蒙特卡洛采样进行贝叶斯模型拟合，并为所有参数设置弱信息先验。模型性能通过期望对数预测密度（ELPD）及其近似估计——帕累托平滑重要性抽样留一交叉验证（PSIS-LOO-CV）以及广泛适用信息准则（WAIC）进行比较。4. 模拟研究验证：通过模拟生成具有预设异质性水平（科恩f值：无、小、中、大）的数据，系统比较扁平模型与层次模型的性能。5. 案例研究数据：应用所提方法于一个真实的多化学物质数据集，该数据集来源于已发表的文献，涉及10种化学物质在啮齿动物中诱导肝细胞增殖（BrdU标记）与肝肿瘤发生率的剂量-反应数据。
研究结果
1. 模拟研究结果
模拟研究表明，层次模型的优势随数据异质性的增加而增大。在无异质性或低异质性时，两种模型性能相近；但当异质性达到中等（科恩f=0.2）或高水平（科恩f=0.5）时，层次模型在ELPD和WAIC指标上均显著优于扁平模型。这验证了所提校准框架的有效性：性能差异能够反映数据中的异质性水平，并且在异质性显著时，层次化校准对于获得可靠的化学无偏qAOP是必要的。
2. 案例研究结果
对非诱变性肝肿瘤qAOP案例数据的探索性分析显示，其化学间异质性水平为小到中等（科恩f=0.17）。模型比较结果（WAIC和LOO差异）明确支持层次模型。图形化分析进一步揭示，在数据密集的低BrdU范围，两模型拟合曲线相似；但在高BrdU范围，层次模型的95%后验预测区间更宽，能更好地覆盖观测数据点，表明其不确定性估计更准确。扁平模型由于未能区分化学特异性变异，低估了参数的不确定性。
3. 基准水平推导结果
基于层次模型推导出的、对应于肿瘤发生率额外增加5%的BrdU基准水平（BML），其均值与下限的比值（1.12）远小于扁平模型的结果（1.91）。这表明层次模型在考虑异质性后，得到了更稳健、不确定性更小的风险评估参考点。从监管角度而言，采用层次模型得出的、更保守的BML下限值作为出发点（Point of Departure）是更为可靠的选择。
研究结论与意义
本研究成功开发并验证了一种用于校准化学无偏定量不良结局通路（qAOP）的新方法。该方法的核心创新在于利用层次建模结构，将多化学物质数据中的化学特异性异质性明确定义为随机效应，从而将其从底层的、共通的通路水平效应中系统地分离出来。
研究通过模拟实验证明，层次校准模型的性能优势与数据中异质性的大小直接相关，该方法本身可作为评估数据异质性程度的工具。更重要的是，案例研究表明，当数据中存在实质性异质性时，未经验证的传统“扁平”qAOP模型会混淆通路效应与化学特异性变异，因此在实践中不能被视作真正的化学无偏模型，其可靠性和普适性将大打折扣。
这项工作的意义深远。首先，它为解决qAOP发展中的关键方法论挑战——实现真正的化学无偏性——提供了切实可行的统计框架。其次，该方法促进了多化学物质数据在qAOP构建中的整合与应用，提高了数据利用效率和模型的证据权重。最后，校准后得到的、更稳健的化学无偏qAOP模型，能够更可靠地支持基于新方法（NAMs）的下一代风险评估，包括更准确地推导基准点（PODs），从而为保护人类健康和环境安全提供更科学的决策依据。本研究标志着在构建可靠、可推广的定量机制性风险评估工具方面迈出了重要一步。
