《Frontiers in Plant Science》：Prime editing: a new frontier in precision genome engineering for rice improvement
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本综述系统梳理了Prime editing（PE）技术从PE1到PEmax的迭代路径，重点解析了其在无需双链断裂（DSB）、无需供体DNA且脱靶风险低的精准编辑优势。文章通过水稻Waxy（wx）基因改良、抗病（如Xanthomonas oryzae）及耐逆性等案例，论证了PE在培育气候韧性与营养强化水稻品种中的转化潜力，为应对2050年全球粮食安全挑战提供了前沿技术视角。
摘要
水稻（Oryza sativa）是全球半数人口的主粮，但气候变化与生物/非生物胁迫严重威胁其产量。传统育种及早期CRISPR/Cas9、碱基编辑（BE）技术虽加速了作物改良，但仍受限于脱靶效应、依赖双链断裂（DSB）及有限的碱基转换类型。Prime editing（PE）自2019年问世，通过“逆转录酶+pegRNA”机制，实现了无需DSB和供体DNA的精准替换、插入与缺失，且脱靶活性更低。本综述追踪了PE系统从PE1至PEmax的进化，重点阐述了pegRNA设计、错配修复（MMR）调控及编辑器架构优化等关键创新。文章进一步展示了PE在水稻改良中的实际应用：通过编辑Waxy（wx）基因提升米质、赋予细菌性条斑病（Xanthomonas oryzae）及除草剂抗性、增强耐热性及恢复营养性状。尽管在编辑效率、递送、生物安全等方面仍存挑战，但twinPE、PASTE等衍生平台的发展，正推动PE成为培育高产、气候韧性、营养强化水稻品种的变革性工具。
1 引言：水稻生产的挑战与技术迭代
1.1 产量与胁迫的双重压力
作为碳水化合物主要来源，水稻养活了全球过半人口。预计到2050年，全球需求将增长近50%，需增产约25%才能满足需求。然而，气候变暖导致的极端温度、洪涝、干旱及病害（如细菌性条斑病Xanthomonas oryzae、稻瘟病Magnaporthe oryzae）造成严重减产，其中细菌性条斑病晚期可导致高达75%的产量损失。
1.2 从传统育种到精准编辑的范式转移
传统育种（如诱变、选择）虽历史悠久，但耗时且受限于遗传多样性。分子生物学发展推动了基因型选择的转型。CRISPR/Cas9与碱基编辑（BE）技术实现了靶向基因修饰，显著提升了产量、抗逆性与营养品质。然而，CRISPR/Cas9依赖DSB，修复过程易产生随机插入/缺失（indels）；BE虽无需DSB，但主要限于C→T或A→G的转换，且存在“旁观者编辑”风险。
1.3 Prime Editing（PE）的突破性优势
2019年，Anzalone等人报道了PE系统，它由切口酶Cas9（nCas9）与逆转录酶（RT）融合而成，由pegRNA引导。其核心优势包括：
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无DSB依赖：仅产生单链切口，避免染色体结构变异。
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编辑类型全覆盖：支持12种碱基替换及小片段插入/缺失。
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PAM限制更少：编辑位点可距切口位点至少33 bp，靶向范围更广。
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高保真：脱靶风险显著低于CRISPR/Cas9。
目前，PE已在水稻中实现从“概念验证”到“性状改良”的跨越，通过优化温度、pegRNA结构及PE架构（如PEmax），编辑效率大幅提升，为培育高产、抗逆、优质水稻提供了新引擎。
2 PE的机制优势：为何优于CRISPR/Cas9与BE？
2.1 CRISPR/Cas9的局限
CRISPR/Cas9源自细菌免疫系统，通过sgRNA引导Cas9在靶点产生DSB，依赖NHEJ或HDR修复。它虽在基因敲除（如抗病基因Xa13、粒型基因GW8）上成效显著，但存在PAM依赖、DSB诱导的基因组不稳定性及HDR效率极低等瓶颈。
2.2 碱基编辑（BE）的窄窗口
BE利用脱氨酶（如CBE的CDA、ABE的TadA）实现单碱基转换。例如，编辑OsSPL14可优化株型，编辑OsWaxy可精细调控直链淀粉含量（1.4%–11.9%）。但其编辑窗口固定，且无法实现颠换突变（如C→A）或片段插入。
2.3 PE的“搜索-替换”机制
PE的工作流程如同“文字处理器的查找替换”：
- 1.
定位：pegRNA的间隔序列结合靶DNA。
- 2.
切口：nCas9切开一条DNA链。
- 3.
逆转录：RT以pegRNA的延伸序列为模板，合成含“新序列”的DNA flap。
- 4.
替换：细胞修复机制将新序列整合进基因组。
这一过程无需DSB，无需外源 donor DNA，且可覆盖所有类型的碱基变化。在水稻中，PE已实现从“单碱基矫正”到“多性状叠加”的精准育种。
3 PE在水稻改良中的实战案例
3.1 米质改良：Waxy（wx）基因的精准编辑
Waxy基因编码颗粒结合淀粉合成酶（GBSS），控制直链淀粉合成。传统突变往往导致全糯或高直链的极端表型。利用PE技术，研究人员在Waxy启动子或编码区引入特定单核苷酸变异（SNV），实现了直链淀粉含量的精细梯度调控（如从低糯到中高直链），既保留了优良食味，又满足了加工需求，且无外源DNA残留。
3.2 抗病与抗除草剂：双链断裂的“零风险”策略
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抗细菌性条斑病：通过PE编辑Xa13或OsSWEET家族基因的启动子区域，破坏病原菌诱导的转录激活，获得广谱抗性，且不影响正常育性与产量。
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抗除草剂：在ALS（乙酰乳酸合酶）基因中引入特定点突变（如Pro171→Ser），赋予对磺酰脲类除草剂的抗性，且无载体骨架整合，符合生物安全监管要求。
3.3 气候韧性：耐热与耐逆
高温胁迫导致水稻育性下降。PE技术通过编辑热休克转录因子（HSF）或热休克蛋白（HSP）的调控元件，增强了花粉发育期的耐热性。此外，在OsbHLH024（盐胁迫负调控因子）或ERA1（ABA信号通路）中引入功能缺失突变，显著提升了耐盐性与抗旱性。
3.4 营养强化：微量元素的“精准恢复”
针对隐性营养不良，PE被用于恢复高锌、高铁或高维生素等营养性状。例如，通过编辑OsNAS（烟酰胺合成酶）或OsVIT（液泡铁转运蛋白）基因，提高了籽粒中微量元素的积累，且避免了传统杂交带来的连锁累赘。
4 挑战与未来展望
4.1 技术瓶颈
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效率不均：不同位点编辑效率差异大，受染色质状态、MMR活性影响。
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递送难题：大片段PE载体（RT融合蛋白）在植物转化中仍具挑战。
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副产物：存在“插入-缺失”副产物，需优化pegRNA设计（如epegRNA）或共表达MMR抑制蛋白（如MLH1dn）。
4.2 下一代平台：twinPE与PASTE
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twinPE（双PE）：通过两个pegRNA同时编辑两条链，实现大片段删除或倒位，可用于删除致病基因或调控大片段非编码RNA。
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PASTE：结合PE与整合酶，实现靶向基因插入，为基因叠加（如抗病+优质）提供新工具。
4.3 监管与生物安全
PE产生的作物无外源DNA整合，且无DSB-induced变异，在监管上更接近传统诱变作物，有望加速非转基因（non-GMO）或轻监管作物的商业化进程。
5 结语
Prime editing（PE）通过“无DSB、高精度、多类型编辑”的特性，正推动水稻育种从“随机突变”向“定制化设计”转型。尽管在效率与递送方面仍需优化，但随着twinPE、PASTE等新平台的涌现，PE有望成为培育气候智能型（Climate-smart）水稻的核心技术，为2050年全球粮食安全提供可持续解决方案。
