治愈无法治愈的疾病：沃顿胶质干细胞囊泡成为治疗猫慢性皮肤溃疡的突破性方法

《Irish Veterinary Journal》：Healing the unhealable: Wharton's jelly stem cell vesicles as a breakthrough for feline chronic skin ulcers

　　摘要：伴侣动物，尤其是猫的慢性皮肤伤口，通常由于愈合反应受损以及潜在的病因（如创伤、术后裂开、压疮、过敏性皮炎或免疫介导的疾病）共同作用而持续存在。因此，有效管理需要准确诊断和治疗这些根本原因，并实施促进组织修复和再生的策略。虽然急性伤口通常在4-6周内通过止血、炎症、增殖和重塑等有序阶段愈合，但慢性伤口会在此期间持续不愈，这通常是由于炎症持续时间过长或一个或多个愈合阶段受到干扰。本研究评估了WJ-MSC来源的EVs对患有持续超过四周的慢性溃疡的成年猫的治疗效果。这些EVs支持重要的生物过程，包括免疫调节、组织再生、细胞稳态、抗炎作用和抗纤维化活性。20只猫被分为两组：一组接受含有Wharton’s Jelly间充质干细胞来源的外泌体（WJ-MSC来源的EVs）的羧甲基纤维素（CMC）凝胶治疗（100 μg EV蛋白/厘米2伤口面积），同时进行标准护理；另一组仅接受自制2%浓度的CMC凝胶治疗。EV治疗显著加速了溃疡愈合，在第16天时伤口收缩明显改善，接近完全闭合（92.4 ± 6.8%），而对照组仅为58.3 ± 12.1%。组织病理学显示EV治疗组的上皮化优于对照组，胶原沉积更早，结缔组织组织更好。免疫组化显示α-SMA和CD31表达增加，表明有活跃的血管生成和组织重塑。此外，划痕实验也显示细胞迁移改善。总体而言，在这项针对宠物猫的初步研究中，WJ-MSC来源的EVs对伤口愈合有积极作用，与单独使用标准护理相比，伤口收缩显著加快，组织学结构也有所改善。然而，由于样本量小、病因和治疗异质性以及研究设计限制，其外部有效性仍有限。这些发现表明WJ-MSC来源的EVs可能是一种有前景的辅助疗法，用于猫的慢性溃疡，但在推荐其作为常规替代疗法之前，需要进行更大规模、按病因分层的试验。进一步的研究应集中在标准化治疗方案、确定最佳患者选择标准以及评估长期效果上。

引言：慢性皮肤溃疡在兽医医学中是一个重要的临床挑战，尤其是在猫和狗等伴侣动物中[1]。因此，有效管理需要识别和控制根本原因，并采取先进的促进愈合策略[2]。与人类医学不同，兽医患者中的慢性伤口更常见于创伤、手术并发症、感染、异物或潜在的过敏和免疫介导的疾病。尽管由于治疗成本、患者寿命较短和主人投入的不同，兽医实践中的总体经济负担可能相对较低，但这些不愈合的伤口仍然会给宠物主人带来巨大的经济和情感压力，常常导致长期治疗、重复的兽医访问，在严重情况下甚至需要安乐死。在猫中，慢性皮肤溃疡通常由以下原因引起：持续的自我伤害（例如蚤类过敏性皮炎、食物过敏、特应性皮炎）、神经性疼痛、未解决或反复的感染（通常是细菌性或混合性感染）、伴有并发症的创伤性损伤或术后裂开。这些因素导致长期炎症，并妨碍了愈合过程[3]。

间充质干细胞具有自然迁移到受损区域的能力[4, 5]，通过释放化学因子、细胞因子和生长因子等多种信号来减轻炎症并促进愈合过程，帮助细胞生长和修复受损组织[6, 7]。主要是通过旁分泌作用，干细胞通过产生外泌体（EVs）来促进伤口愈合，这些EVs是强大的修复介质[8, 9]。这些MSC来源的EVs携带复杂的核酸、蛋白质和脂质负荷，能够实现细胞间的有效通信[10]，对于加速伤口愈合和促进疤痕形成至关重要[11, 12]。已证明，来自人类脐带MSC的EVs特别能促进血液凝固[13]，这是伤口修复早期止血阶段的关键功能。通过诱导血管收缩和促进血小板聚集，它们在这一阶段成功减少了血液流失，为后续愈合阶段奠定了基础[8]。间充质干细胞来源的外泌体（MSC-EVs）可以调节巨噬细胞的极化[14]，促进从促炎型M1巨噬细胞向抗炎和修复型M2巨噬细胞的转变，这表现为白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子α的释放。当巨噬细胞处于修复阶段时，它们会释放TGF-β和IL-10等信号分子，减少炎症并表明组织正在愈合[15]。值得注意的是，MSC-EVs表现出独特的表面标志物组合，包括间充质干细胞特征抗原CD44、CD73和CD90，以及常见的外泌体抗原CD63、CD9和CD81[16, 17]。研究发现，MSC-EVs激活了PI3K/AKT通路，这对伤口愈合至关重要[18, 19, 20]。由于这种激活，TGF-β1和纤维连接蛋白的表达增加，从而改善了上皮化并促进了成纤维细胞的迁移和增殖。这增加了I型和III型胶原蛋白、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）以及其他对组织再生和修复至关重要的ECM相关蛋白的分泌[5, 12, 21]。血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胎盘生长因子（PlGF）、胰岛素样生长因子（IGF）和最重要的血管内皮生长因子（VEGF）属于MSC产生的几种促血管生成因子，可以控制血管生成[22, 23, 24, 25]。此外，它们还改变了血管生成指标的细胞表面蛋白，如血小板内皮细胞黏附分子（PECAM-1）/CD31[26, 27]。此外，通过组织修复和肿瘤微环境的诱导，MSCs可以转变为收缩性肌成纤维细胞（MFs），从而形成含有α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的新应力纤维[28]。肌成纤维细胞表达细胞外基质，并负责肉芽组织中的收缩，α-SMA作为肌成纤维细胞的特异性标志物[29, 30]。Wharton’s Jelly（WJ）是一种结缔组织，为脐带提供结构稳定性。其主要成分包括胶原蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖，共同形成了富含愈合特性的细胞外基质[31]。WJ富含MSC，且获取相对容易，因为通常在采集过程中不会对供体造成伤害，之后会被丢弃[32, 33]。使用WJ-MSC收集的EVs治疗持续超过四周的慢性溃疡的疗效尚未被探索。尽管有令人鼓舞的临床前证据支持MSC来源的外泌体（EVs）在各种哺乳动物伤口模型中的再生潜力，但其在伴侣动物自然发生的慢性皮肤溃疡中的治疗效果仍很大程度上未被研究。这一知识空白促使了本研究，其研究问题是：局部施用Wharton’s Jelly间充质干细胞来源的EVs能否加速猫慢性皮肤溃疡的愈合并改善组织再生？

材料与方法：
试剂：胶原酶VI、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、培养基、RPMI培养基、牛血清白蛋白均购自(SigmaA，美国)；含25 mM HEPES的Medium 199、Beckman Coulter Optima L 90 K超速离心机、抗CD31抗体购自(Abcam，英国)；HRP偶联的二抗购自(Aspen，中国)；二氨基苯胺（DAB）。

WJ-MSC的分离和鉴定：取两克Wharton’s Jelly组织切成1-2毫米的小块，在100毫米培养皿中用培养基培养七天。然后用胶原酶VI（2 mg/ml）在37°C下酶解组织块1.5小时。消化后，过滤溶液以去除未消化的组织，以200 × g离心，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次。细胞离心后重悬在10毫升培养基中，再以700 × g离心。然后在37°C下含5% CO?的条件下孵育，每三天更换一次培养基。当细胞达到汇合时，使用倒置显微镜观察纺锤形和平坦的细胞(图1a和b)。使用CD34、CD45、CD73和CD90标记物评估细胞形态和流式细胞术分析。

图1： Wharton’s Jelly间充质干细胞（WJ-MSC）的形态学和流式细胞术分析。a 70%汇合度的细胞显示典型的纺锤形状；b 完全汇合的细胞形成单层。流式细胞术分析显示(c)中CD90高表达（99%），(d)中CD45低表达（0.29%），(e)中CD73高表达（91.2%），(f)中CD34低表达（0.88%），表明其为MSC。

WJ-MSC EVs的鉴定：在第四代（5 × 10?细胞/毫升）的干细胞上清液中，使用不含胎牛血清（FBS）的Roswell Park Memorial Institute (RPMI)培养基并添加0.5%牛血清白蛋白（BSA，SigmA，美国）来提取外泌体（EVs）。离心上清液2000 × g 20分钟后，再用Beckman Coulter Optima L 90 K超速离心机以4 °C和100,000 × g的条件超速离心一小时。然后用不含血清的199培养基（含25 mM HEPES，SigmA，美国）清洗上清液，再进行第二次超速离心。使用Bradford技术（BioRad，Hercules，CA）测定EVs的蛋白质含量，并将样品保存在-80 °C的收集介质中直到需要使用为止。

WJ-MSC EVs的进一步鉴定：如图2B、C、D和F所示，通过流式细胞术进一步分析了Wharton’s Jelly间充质干细胞来源的EVs表面CD9、CD63和CD81的蛋白表达。分离的WJ-MSC外泌体被固定并安装在Formvar涂层的铜网格上。吸附后，网格被洗涤、 negative染色并风干。使用透射电子显微镜检查细胞形态和大小。图像分析使用适当的成像软件进行。

图2： Wharton’s Jelly间充质干细胞来源的外泌体（WJ-MSC EVs）的特性及伤口愈合效果。A、B、C 流式细胞术分析显示WJ-MSC外泌体（EV）表面标记物CD9（88.7%）、CD63（91.0%）和CD81（89.2%）的高表达，表明分离出的EV的纯度和身份明确。D 透射电子显微镜（TEM）显示EV具有典型的球形形态和纳米级大小（34.73 nm），并且膜结构完整，证实了功能性囊泡的成功分离。

**伤口愈合（或划痕）实验**
为了评估EV促进细胞迁移的能力，还进行了划痕伤口实验。将间充质干细胞接种在24孔细胞培养板上，使用200 μL移液器在细胞单层上划出一条直线，形成划痕。然后，在37°C下孵育细胞，并向相应的孔中加入500 μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）或Wharton's Jelly间充质干细胞（WJ-MSC）外泌体（EV）。通过倒置显微镜跟踪并统计划痕距离。如图2c和图3所示，迁移率使用以下公式计算：迁移率（%）=（L0—Lt）/ L0 × 100%，其中L0是初始划痕宽度，Lt是给定时间t的划痕宽度。

**图3**
(A) 划痕伤口愈合实验显示，与对照组相比，WJ-MSC EV处理组的细胞迁移显著增强，这一效果在0、12、24和48小时时都得到了验证，证实了其促进再生的作用。在24小时时，EV处理组与对照组之间存在统计学显著差异（*P < 0.01），在48小时时差异更为显著（**P < 0.001**。
(B) 比较了对照组和WJ-MSC EV处理组在0、12、24和48小时内的细胞迁移率。对照组的细胞迁移率从0小时时的5%逐渐增加到12小时时的15%、24小时时的20%和48小时时的35%。相比之下，WJ-MSC EV处理组的细胞迁移率从0小时时的10%显著增加，到12小时时的30%、24小时时的40%和48小时时的60%。

**动物研究设计**
本研究设计为一项前瞻性、随机、双盲、对照临床试验，比较WJ-MSC衍生的EV疗法与标准护理对患有慢性溃疡的宠物猫的效果。研究对象为20只雌雄各半的成年猫，体重在5至10公斤之间，溃疡持续时间超过四周。在伦敦宠物诊所，这些动物被安置在适当的单独笼中，可以自由饮水和进食常规猫粮。实验环境维持12小时的明暗周期、20 ± 2°C的温度以及适宜的相对湿度和噪音水平。Kafr Elsheikh大学的动物使用伦理委员会批准了这项研究（批准协议KFS-IACUC/207/2024）。所有猫均为宠物所有，所有主人在纳入研究前都获得了书面同意书。主人了解了研究方案，包括16天的住院期、潜在风险和益处。为降低压力，猫被单独安置在配备隐蔽箱、高架栖木和熟悉家居垫料的丰富环境中。每天提供增强活动并采取温和的处理方式。保持安静的环境，尽量减少噪音干扰。虽然这不代表典型的家庭环境，但两组动物都接受了统一的饲养条件，以减少治疗效应的差异。本研究遵循ARRIVE指南2.0的报告建议，认识到尽管这些是宠物而非实验动物，但透明的报告标准可以提高研究的可重复性。动物被分为两组：

**研究方法**
本研究采用双盲、随机对照实验，比较间充质干细胞（MSC）产生的外泌体与传统伤口愈合方法的有效性。使用G*Power软件（版本3.1.9.2）计算样本量，设定alpha错误为0.05、功效为80%、效应大小为0.377，得出每组至少需要16只猫。由于这是一项住院研究且动物受到密切监测，因此认为脱落风险较低。为了保守起见，并考虑到潜在的不可预见事件（例如因非相关健康问题或违反协议而提前终止实验），我们增加了20%的扩增因子，计划招募20只猫。研究过程中没有动物脱落。

**分组**
**对照组**：10只患有慢性溃疡的猫，仅接受羧甲基纤维素（CMC）凝胶治疗，同时接受标准护理。
**EV治疗组**：10只患有慢性溃疡的猫，接受含有CMC凝胶的外泌体治疗，同时接受标准护理。

**纳入标准**
任何品种和性别的猫，诊断为非愈合性皮肤伤口或溃疡，包括创伤性伤口、慢性伤口或持续超过4周的溃疡。尽管接受了至少4-6周的适当病因导向的标准护理，伤口仍未愈合。除正在治疗的伤口或溃疡外，动物的总体健康状况稳定（ASA1分类）。

**排除标准**
年龄低于6个月或超过15岁。活动性系统感染或败血症。存在未经治疗的恶性肿瘤或正在接受活跃癌症治疗。对干细胞衍生产品或外泌体有过敏史。母猫怀孕或哺乳。有显著的凝血功能障碍或出血性疾病。

**动物福利和饲养**
参与者在16天内每4天接受一次不良反应监测。若因医疗原因、家属撤回同意或违反协议，可随时终止实验。

**临床评估**
**伤口愈合评估**
通过伤口收缩比例来评估伤口愈合情况。治疗前，伤口边缘的直径每天减少一定毫米，具体情况见表3。

**计算伤口收缩百分比**
伤口收缩以初始伤口面积的百分比来衡量。使用以下公式计算每个动物组的伤口收缩比例：
收缩百分比 = （第0天的伤口面积 - 第n天的伤口面积）/ 第0天的伤口面积 × 100%。
伤口直径使用尺子测量，如图3和表3所示，n是我们观察非愈合溃疡伤口的天数（4、8、12和16天）。使用公式 Area = πr2 （其中r2 = 直径，π约等于22/7）计算伤口面积。测量并记录原始伤口面积（第0天的伤口面积），然后计算每只猫的伤口收缩比例。

**诊断检查及基础病因管理**
在纳入研究前，所有猫都接受了全面的诊断评估，以确定潜在的病因或持续因素。包括详细病史、全面的身体和皮肤检查、皮肤细胞学检查、深层皮肤刮片、细菌和真菌培养（必要时），以及针对疑似瘙痒/过敏情况的饮食调整或环境过敏原控制。排除患有未控制的系统性疾病、活跃恶性肿瘤或未经治疗的严重感染的病例。在研究期间，继续进行病因导向的治疗，并同时进行实验方案。确保WJ-MSC衍生的EV作为辅助疗法，在最佳管理原发和持续因素的基础上进行评估。

**治疗产品的制备和局部应用**
外泌体（EV）在使用前立即悬浮在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。使用Bradford法测定EV制剂的蛋白质浓度，并按照每平方厘米伤口表面面积100 μg的总EV蛋白的标准剂量进行应用。EV批次的平均浓度为2.8 × 10?个颗粒/μL（批次间范围为2.5–3.2 × 10?个颗粒/μL）。因此，实际应用的剂量约为每平方厘米伤口面积2.8 × 1011个EV颗粒。使用羧甲基纤维素（CMC）凝胶（2% w/v，无菌）作为载体。对于EV治疗组，在应用前将所需体积的EV悬浮液均匀混合到CMC凝胶中，以达到目标蛋白剂量。对于对照组，在CMC凝胶中加入等量的PBS。涂抹约2毫米厚的凝胶层，相当于每平方厘米伤口面积0.2毫升的凝胶。治疗区域包括伤口床及其周围5毫米的皮肤。两组均接受相同的标准护理，包括根据临床需要使用的病因导向的全身或局部药物：抗生素（根据培养和敏感性结果选择阿莫西林-克拉维酸钾或头孢呋辛）、抗瘙痒治疗（针对瘙痒相关情况使用奥拉克西替尼或环孢素）和止痛管理（根据需要使用丁丙诺啡或美洛昔康）。所有猫每天都会用无菌盐水清洁伤口并包扎。

**疼痛评估**
使用经过验证的Feline Grimace Scale（FGS）评估慢性溃疡相关的疼痛，这是一种可靠且公认的评估猫急性及慢性疼痛的工具。评分由一名对治疗分配不知情的训练有素的观察者每天进行。FGS评估五个指标（耳朵位置、眼眶紧张度、口鼻部紧张度、胡须位置和头部位置），每个指标的评分范围从0（无）到2（明显存在），总分为10分。得分≥4/10表示需要止痛干预。

**组织病理学评估**
在治疗后的第3天、第7天、第14天和第21天，从病变部位采集皮肤样本，使用苏木精和伊红（H&E）染色进行组织学评估。此外，从伤口边缘取全层6毫米厚的活检样本，包括病变组织和周围健康组织，以便比较愈合进展。每次时间点每只动物取一个活检样本。活检部位用不可吸收缝线缝合，并进行标准的术后护理。为了避免对动物的过度负担，活检时间错开，确保没有一只猫在研究期间接受超过两次活检（例如，第3天和第14天，或第7天和第21天）。

**照片记录和结果比较**
拍摄照片，并在这些时间点比较伤口的组织病理结构。根据表皮形态、伤口边缘之间的距离以及胶原纤维和成纤维细胞的方向，使用评分系统评估伤口表面的愈合情况（见表1和表2，以及图6、7、8和9）。

**数据分析**
表1显示了EV治疗组和对照组在多个观察点（T0 = 入院时，T4 = 第4天，T8 = 第8天，T12 = 第12天，T16 = 第16天）的伤口平均面积和伤口缩小百分比。

**活检取样和理由**
在治疗开始后的第3天、第7天、第14天和第21天，在镇静或轻度麻醉下采集皮肤活检样本，以评估组织学愈合和组织重塑的时间进程。第3天和第7天的样本捕捉了早期炎症和增殖阶段，第14天的样本代表了中期肉芽组织和上皮再生，第21天的样本评估了局部治疗停止后的晚期胶原成熟和表皮恢复情况。所有动物的临床伤口监测和治疗应用均在第16天结束。然而，为了在第21天获得组织学结果而不延长每日干预时间，治疗在第16天终止，动物在活检前继续被饲养，直到第21天进行活检。

**免疫组化（IHC）评估伤口血管化**
对用于H&E染色的相同福尔马林固定、石蜡包埋的活检样本的连续切片进行α-SMA和CD31的免疫组化（IHC）检测。因此，每个时间点只需要一个活检样本。在第3天、第7天和第21天进行免疫组化（IHC）。将一级抗体（抗CD31，1:100，Abcam，英国）与组织切片在4°C下孵育整夜。然后加入HRP耦合的二级抗体（Aspen，中国）。使用二氨基联苯胺（DAB）进行染色。计算每个区域中的管状结构，这些结构被视为新形成的血管。α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的DAB-过氧化物酶染色可能表明持续的纤维化过程，这可能与持续的炎症或疤痕有关。有效的伤口愈合和组织修复依赖于活跃的血管生成，这可通过CD31阳性染色来指示。

**结局指标**
**主要结局：** 16天内伤口面积的百分比减少。
**次要结局：** 肉芽组织形成、上皮化率以及通过研究者报告的疼痛评估结果。数据收集与报告
伤口尺寸使用图4和表3中所示的米尺进行测量。在4天的访问期间，记录了肉芽组织、感染标志物和疼痛水平。图4（全尺寸图像）展示了使用细胞外囊泡（EV）处理的组与对照组在16天内的伤口愈合进程对比。第4天、第8天、第12天和第16天拍摄的连续图像清楚地显示了EV处理组的伤口闭合率差异。

统计分析
本研究使用SPSS 18.0软件分析数据。在各个时间点进行组间比较时，采用了Student's t检验，显著性水平为：*P<0.01 和 **P<0.001。结果以均值±标准差（SD）表示。为了提高主要结果的可解释性，还在结果部分及相关图表中报告了伤口面积组间差异和伤口收缩百分比的95%置信区间（95% CI）。

干细胞特征
在倒置显微镜下观察了WJ-MSCs的形态特征，细胞通常呈现纺锤形、较大且扁平的形态，并具有明显的成纤维细胞特征，显示出明显的细胞质延伸。它们的均匀大小和细长的形状表明其具有健康的增殖潜力，如图1A（细胞融合度为70%）和图1B（完全形成的细胞层）所示。流式细胞术显示CD90（99%）和CD73（91.2%）的高表达水平，而CD34（0.88%）和CD45（0.29%）的表达水平较低，这些特征符合间充质干细胞的特性；这些在图1（C-F）中清晰可见。

伤口愈合或划痕实验分析及WJ-MSC EVs特征
划痕实验结果如图3（A）和（B）所示，展示了Wharton Jelly间充质干细胞（WJ-MSC）衍生的细胞外囊泡（EVs）对细胞迁移的影响。以划痕闭合百分比表示的迁移率在EV处理组中显著高于对照组，分别在0小时、12小时、24小时和48小时时。对照组在0小时时的细胞迁移率为5.0±2.5%（95% CI 3.2–6.8%），反映了初始测量变异性以及划痕形成后立即发生的轻微自发细胞运动，而非活跃的迁移。这一基线差异不具有统计学意义，但逐渐增加，在12小时时达到15.0±4.2%（95% CI 12.0–18.0%），24小时时为20.0±5.1%（95% CI 16.4–23.6%），48小时时为35.0±8.9%（95% CI 28.6–41.4%）。在WJ-MSC EV处理组中，0小时时的迁移率为10.0±3.6%（95% CI 7.4–12.6%），12小时升至30.0±6.3%（95% CI 25.5–34.5%），24小时为40.0±7.8%（95% CI 34.4–45.6%），48小时为60.0±7.2%（95% CI 54.8–65.2%）。24小时时，对照组的迁移率为20.0±5.1%（95% CI 16.4–23.6%），而WJ-MSC EV处理组的迁移率为40.0±7.8%（95% CI 34.4–45.6%）；平均差异为20.0%（95% CI 13.7–26.3%，*P<0.01）。这些结果表明WJ-MSC衍生的EVs有效增强了细胞迁移，促进了更快的划痕闭合。

从Wharton’s Jelly间充质干细胞中分离出的细胞外囊泡（EVs）通过流式细胞术和透射电子显微镜（TEM）进行了表征。如图2（A, B, C）所示，流式细胞术分析揭示了这些囊泡表达了细胞外囊泡表面标志物CD9、CD63和CD81。CD9、CD63和CD81的阳性表达率分别为88.7%、91.0%和89.2%，表明外泌体的高纯度及其成功分离。此外，TEM分析（图2D）显示这些囊泡具有典型的圆形、杯状形态，平均直径为34.7±5.2 nm（95% CI 32.1–37.3 nm）。这些囊泡看起来是具有清晰脂质双层的球形膜结合纳米结构，与已知的间充质干细胞衍生外泌体形态一致。

伤口面积测量
所有20只参与研究的猫（补充文件）均完成了16天的研究方案，没有退出或方案偏差。图4展示了使用细胞外囊泡（EV）处理的组与对照组在16天内的伤口愈合进程对比。第4天、第8天、第12天和第16天拍摄的连续图像清楚地显示了EV处理组的伤口闭合率差异。到第4天时，EV处理组显示出明显的伤口收缩。第8天时，EV处理的伤口进一步减小，肉芽组织开始形成，这对组织修复至关重要。到第12天时，EV处理的伤口显示出愈合进展，伤口闭合显著，伤口床呈现更有序的状态。最终，在第16天时，EV处理组的伤口几乎完全闭合，平均伤口收缩率为92.4±6.8%，而对照组仅为58.3±12.1%（平均差异34.1%，95% CI 25.6%至42.6%）。EV处理组的剩余伤口面积也相应减小（平均差异–3.8 cm2，95% CI –5.2至–2.4 cm2）。

图5和表1表明，EV处理组的伤口愈合速度明显快于对照组。到第8天、第12天和第16天时，EV组的伤口尺寸显著减小，伤口闭合百分比更高，在第16天时接近完全闭合，而对照组愈合进度较慢（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

组间伤口愈合进展比较。A为伤口面积（cm2），B为随时间变化的伤口收缩百分比。数据为均值±标准差（n=每组10只）。第16天的组间平均差异及其95%置信区间在文本（“伤口面积测量”部分提供）。显著性标志：dii<0.05，**P<0.01，***P<0.001（Student’s t检验）。

基线人口统计学和伤口特征在EV处理组与对照组之间具有可比性，证实了随机化的成功性和招募时不存在主要混淆变量。数据以均值±标准差或n（%）表示。连续变量的p值使用Student’s t检验计算，分类变量（病因分布）使用Fisher’s exact检验计算。*两组之间未观察到显著差异（所有p>0.05），证实基线可比性。

组织病理学结果
用苏木精和伊红（H&E）染色的伤口切片显示在图6、7、8和9中，EV组的愈合特征包括形成组织良好的纤维结缔组织，炎症细胞减少，表皮和汗腺形成，细胞密度增加，血管化增强，角质形成细胞增多，伤口部位完全重新上皮化。然而，仍有许多未分化的表皮细胞。伤口部位的真皮显示出增强的真皮成纤维细胞和胶原纤维沉积。至于CMC组的愈合，其特征是形成纤维结缔组织，并伴有大量的单核炎症细胞浸润，表面覆盖有痂皮，见图6、7、8和9以及表3和表4。

图6（全尺寸图像）的面板（A、B、C、D）展示了第3天的H&E染色伤口组织，比较了EV处理组（A、C）和对照组（B、D）。EV处理组显示出早期形成的纤维结缔组织（由星号表示）和适量的单核炎症细胞浸润（由箭头表示），表明早期愈合。对照组（B、D）的结缔组织显得无序，炎症细胞密度较高，表明愈合反应延迟。

图7（全尺寸图像）的面板（A、B、C、D）展示了第7天的H&E染色组织。EV处理组（A、C）的伤口显示出更有序的纤维组织（由星号表示）和较少的炎症细胞（由箭头表示），表明组织持续成熟。对照组（B、D）的结缔组织仍较为无序，炎症细胞持续存在，表明愈合过程较慢。

图8（全尺寸图像）的面板（A、B、C、D）代表了第14天的组织学发现。EV处理组（A、C）的样本显示出组织良好的结缔组织（由箭头表示），炎症浸润较少（由星号表示），表明愈合进展较快。对照组（B、D）的组织较为无序，炎症持续存在，表明愈合过程较慢。

图9（全尺寸图像）的面板（A、B、C、D）展示了第21天的结果，EV处理组（A、C）的伤口显示出成熟的、有序的结缔组织，完整的表皮层形成（由星号表示），炎症极少（由箭头表示）。对照组（B、D）的组织组织较不完整（由星号表示），炎症细胞仍然存在，突出显示了EV处理的愈合效果增强。

表4 使用胶原蛋白和成纤维细胞排列评估伤口愈合成熟度

使用α-SMA和CD31染色的免疫组化分析显示EV处理组与对照组在血管生成方面存在显著差异（图10、11）。在EV处理的伤口中，α-SMA染色在新形成的血管壁中显示出阳性反应，表明活跃的纤维增殖过程和组织修复。CD31染色在这些样本中也显著阳性，反映了强烈的血管生成，这是有效伤口愈合的关键组成部分。这种增强的血管化早在治疗后的第3天和第7天就在EV处理组中被观察到，表明细胞外囊泡处理促进了比对照组更快的血管反应。相比之下，对照组显示出有限的α-SMA和CD31表达，表明新的血管形成较少，愈合进展较慢。

图10（全尺寸图像）的面板（A、B、C、D）展示了第3天的α-SMA和CD31 IHC染色图像，突出了EV处理组与对照组之间的血管化差异。EV处理组显示出阳性的α-SMA和CD31染色（A、C），表明新血管的形成，而对照组显示出较低的血管活性（B、D），表明血管生成反应较慢。

图11（全尺寸图像）的面板（A、B、C、D）展示了第7天的IHC染色结果。EV处理的伤口显示出强烈的α-SMA和CD31染色（A、C），表明强烈的血管生成和增强的组织修复支持。相比之下，对照组的染色较弱（B、D），表明血管发育较慢，愈合延迟。

图12（全尺寸图像）展示了EV处理与对照组在不同时间点（T0、T3、T7、T14、T21）的伤口愈合和组织组织方面的优越性。T21时，EV组达到了完全愈合和完美的组织排列（得分=0），而对照组愈合较慢，伤口表面仍有残留（得分=3），组织排列也不理想（得分=2）。

讨论
这项随机对照试果表明，局部应用的WJ-MSC衍生EVs显著加速了猫自然发生的慢性皮肤溃疡的愈合，解决了兽医皮肤病学中一个常见且治疗上具有挑战性的问题[34,35,36]。直到最近，慢性伤口护理还常常依赖于过时的方法。然而，如今，在预防、诊断和治疗方面的进步彻底改变了这些持续性疾病的护理方式。这一进展源于对细胞和分子生物学的更深入理解、尖端的生物医学工程创新以及更加强大的严格、可靠的临床研究能力[27, 37, 38]。

本研究的结果与Chen等人的研究一致，他们发现通过触发ERK/MAPK通路，来自ADSCs的外泌体可能增加胶原I与胶原III、TGF-β3与TGF-β1、MMP3与TIMP1的比例。这种激活有助于防止成纤维细胞分化为肌成纤维细胞[30, 39]。通过上调CD31和α-SMA的表达，我们的研究发现内皮细胞和平滑肌细胞的活跃生长得到了突出显示。间充质干细胞（MSC）的外泌体不仅加速了表皮再生，还促进了重要皮肤结构（如皮脂腺和毛囊）的发育，这些结构对于组织再生所需的强大血管化至关重要[40]。在体外划痕试验中观察到的细胞迁移增强支持了WJ-MSC来源的外泌体（EVs）的促迁移效应，这可能有助于猫溃疡临床观察到的加速表皮再生和伤口收缩。这表明WJ-MSC来源的EVs在促进细胞迁移和加速伤口愈合过程中起着关键作用[35, 41]。临床数据显示，接受EV治疗的组别在治疗后第四天伤口大小显著缩小，到第十六天几乎完全愈合，明显优于对照组。这种有益效果可能是由于EVs在愈合早期阶段能够控制炎症反应，尤其是通过触发巨噬细胞迁移实现的。M2c巨噬细胞以产生高水平的IL-10、MMP-9、IL-1β和TGF-β而著称，同时保持低水平的IL-12。此外，它们表达CD163，这是一种对抗炎症反应至关重要的血红蛋白受体[42]。本研究的结果与先前的研究一致，后者表明由人类脐带间充质干细胞（huc-MSCs）衍生的EVs可以通过miR-181C调节烧伤大鼠的巨噬细胞活性，抑制TLR4信号通路并降低IL-10水平，从而促进M2极化并控制炎症反应[43,44,45]。在本研究中，两组间疼痛评分没有显著差异，这可能反映了这些慢性溃疡相关的相对轻微的基础不适，以及两组都有效的疼痛管理。由于样本量较小（每组10只猫），统计功效和普遍性受到限制。尽管基线特征和伤口病因在两组间进行了平衡，但需要更大规模的多中心研究来确认其在不同猫种、品种和临床环境中的有效性。

Kim等人报告称，由脂肪干细胞（ASCs）衍生的EVs能够以剂量依赖的方式加速皮肤成纤维细胞的增殖[46]。Gangadaran等人发现，huc-MSCs释放的EVs通过Wnt4蛋白刺激皮肤细胞的β-连环蛋白信号通路，提高其迁移和增殖能力，并逆转AKT通路的阻断，增加皮肤细胞的存活率[47, 48]。在EV治疗组中，早在第3天和第7天就观察到了CD31阳性血管密度和α-SMA表达的显著增加，这表明WJ-MSC来源的EVs诱导了快速而强大的血管生成，这似乎是这种猫慢性溃疡模型中加速伤口闭合的主要驱动力[36, 49, 50]。这种早期的血管反应可能改善了伤口床的氧气和营养供应，促进了修复细胞的募集，并支持了随后通常因持续炎症、自我创伤或肉芽组织形成不足而在猫非愈合性溃疡中延迟或失调的表皮再生和胶原蛋白成熟过程[41, 51]。时间模式特别有信息量：血管生成先于伤口收缩的主要加速（从第8天开始显现），到第21天时已有成熟的组织重塑的组织学证据。这一序列表明了一个机制级联反应，其中EV诱导的内皮激活和肌成纤维细胞分化为后续的增殖和重塑阶段创造了更加有利的环境。虽然我们不能排除抗炎作用或直接刺激角质形成细胞/成纤维细胞迁移的贡献（如划痕试验中所见），但在对照组没有类似变化的情况下，早期血管的持续增强强烈表明血管生成是这一过程中的主导机制。从临床角度来看，刺激早期有效的新血管生成对于管理猫的慢性溃疡尤为重要，因为不良的血管供应常常在感染或瘙痒得到控制后仍然导致非愈合状态[52]。通过解决这一关键瓶颈，EV疗法有潜力缩短治疗时间，减少长期包扎或系统药物的需求，并改善长期的组织质量，从而显著减轻患者的不适和主人负担[53]。

本研究存在一些重要的局限性。此外，仅使用一种动物模型限制了结果在其他物种（包括人类）中的适用性。该研究集中在16天内的短期愈合结果上，未探讨长期结果，如组织持久性和潜在的疤痕形成。尽管外泌体（EVs）与对照组进行了比较，但未将其效果与其他先进的伤口愈合治疗方法进行对比，从而限制了其效果的广泛性。研究未探讨供体组织或分离方法等因素对EV组成的影响，这引发了关于其他情况下发现的一致性问题。此外，虽然测量了细胞生长和血管形成，但进一步探究免疫系统和愈合通路的作用本可以揭示更多关于这些效应的机制。此外，由于部分猫是流浪猫或新收容的动物，因此缺乏完整的医疗史，这限制了我们全面描述治疗前时间和先前治疗干预的能力，可能影响了基线伤口特征。一个主要限制是所包括的溃疡病因具有极强的异质性（创伤、裂开、压疮、过敏性皮炎、免疫介导的疾病）。由于每组只有10只猫，按病因分层是不可能的。不同的根本原因可能对EV疗法有不同的反应，限制了我们发现的一般性。需要更大规模的研究，并进行针对特定病因的亚组分析。虽然猫根据临床症状接受了不同的系统治疗（各种抗生素、抗瘙痒剂、镇痛剂），但这引入了治疗异质性作为潜在的混淆因素。虽然两组接受了相同的标准化护理，但不能排除同时使用药物对伤口愈合的不同影响。此外，在研究期间对相对较小的伤口进行了多次穿刺活检（每只猫最多两次）。这些程序虽然对组织学评估是必要的，但可能通过机械干扰和局部炎症干扰了自然的伤口愈合过程，可能会影响观察到的治疗效果，特别是在较小的伤口中。

结论：本研究表明，以羧甲基纤维素凝胶递送的Wharton’s Jelly间充质干细胞来源的外泌体（WJ-MSC-EVs）局部应用显著加速了对标准治疗耐药的猫慢性皮肤溃疡的愈合。该治疗促进了更快的伤口收缩，增强了表皮再生，改善了胶原蛋白组织，减少了炎症，并刺激了早期血管生成，这些都是由持续瘙痒、自我创伤、反复感染或创伤/术后并发症引起的猫非愈合性溃疡常见的缺陷。从实际角度来看，WJ-MSC-EVs在日常兽医临床应用中具有多个优势：它们提供了一种无细胞、现成的再生疗法，免疫原性风险低，应用简单，且无需采集供体或复杂的细胞培养。在猫患者中，这种方法有可能缩短治疗时间，减少长期使用系统药物（如长期抗生素或皮质类固醇）的需求，通过减少就诊次数减轻主人的负担，并通过减轻不适和疤痕形成来提高生活质量。鉴于猫慢性溃疡的高发率以及现有疗法的局限性，这些发现支持将基于EV的辅助治疗引入兽医皮肤病学和伤口管理，作为一种有前景且可行的选择。未来在更大样本量和多中心环境中的临床研究将有助于确认其在不同猫品种、伤口病因和临床环境中的有效性，并优化剂量和递送方案。