《Nature Communications》：Comparison and optimization of cellular neighbor preference methods for quantitative tissue analysis
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本研究针对空间组学分析中多种细胞邻域偏好（NEP）方法缺乏统一评估与选择标准的问题，系统比较了包括histoCAT、SEA、Giotto、IMCRtools、Squidpy、Scimap、Misty和CellCharter在内的现有方法，并在此基础上提出了一种新的条件Z值（COZI）分析组合。研究者通过模拟和生物数据集（三阴性乳腺癌和心肌梗死）验证，表明COZI在区分不同组织结构和捕捉NEP方向性方面具有高灵敏度，为定量空间数据提供了敏感且具有方向性的分析工具，显著提升了组织空间量化分析的准确性与可解释性，对理解疾病进程和开发靶向治疗策略具有重要意义。
在探索生命奥秘的拼图中，理解细胞在组织中的空间排布是至关重要的一块。这不仅能揭示健康组织的运作机制，更是解开疾病（如癌症、自身免疫病）发生发展之谜的关键。近年来，空间生物学技术的飞速发展，让我们得以以前所未有的精度，在细胞和分子水平上捕捉组织的空间特征。随之而来，是众多计算方法的涌现，旨在分析这些海量数据中的空间模式。其中，细胞邻域偏好（Neighbor Preference, NEP）分析是一种被广泛应用的手段，它试图回答一个核心问题：在组织中，不同类型的细胞是否倾向于（或避免）互为邻居？
尽管NEP分析已在肿瘤学、免疫学等领域提供了诸多新见解，但一个尴尬的现实是：市面上存在多种NEP计算方法（如histoCAT、Giotto、Squidpy等），它们各有千秋，结果也常不一致。研究者们在选择方法时往往“跟着感觉走”，缺乏明确的指导。这就好比用不同的尺子去测量同一个物体，得到的读数可能大相径庭。更关键的是，细胞间的“偏好”可能具有方向性——例如，免疫细胞倾向于向肿瘤细胞迁移，但反之则不然。这种方向性隐含着细胞通讯或迁移的模式，对理解免疫激活、肿瘤免疫逃逸等过程至关重要，但现有的方法在捕捉这种方向性的能力上参差不齐。为了给这个领域带来清晰的指引，并开发更优的分析工具，研究人员开展了一项系统性研究，对现有主流NEP方法进行了全面比较与评估，并在此基础上提出了一种新的优化组合方法。这项研究成果已发表在《自然·通讯》（Nature Communications）上。
为了达成研究目标，作者团队主要运用了以下几项关键技术：首先，他们利用“体外模拟组织”生成框架，创建了具有已知空间架构（如同胞偏好强度、交叉偏好方向性）的模拟组织数据集，为方法比较提供了“金标准”。其次，他们采用了包括SpaSim在内的组织模拟器，生成了模拟免疫细胞浸润等复杂生物场景的数据。在生物验证方面，研究分析了两套真实世界的空间组学数据集：一套是来自Keren等人的三阴性乳腺癌多重离子束成像数据，用于研究免疫-肿瘤细胞混合状态；另一套是来自Wünnemann等人的小鼠心肌梗死时序性免疫荧光数据，用于追踪免疫细胞在损伤后的动态浸润过程。最后，研究整合并系统应用了多种现有的NEP分析工具包（包括histoCAT、SEA、Giotto、IMCRtools、Squidpy、Scimap、Misty和CellCharter），并基于分析步骤的解构，自行开发实现了新的条件Z值（COZI）方法。
结果部分的研究发现如下：
统一NEP分析中的概念与算法
研究首先将各种NEP方法解构为三个核心分析步骤：邻域定义、邻居量化和NEP评分。通过这一框架，他们清晰地梳理了各方法在实现上的异同，例如在量化步骤中，有的方法使用“整体”归一化（除以索引细胞类型的总数），有的则使用“条件”归一化（只考虑至少有一个特定类型邻居的索引细胞）。正是这种步骤组合的差异，决定了方法捕捉空间关系，特别是方向性的能力。
评估NEP方法的队列区分灵敏度
通过模拟具有不同自我偏好强度的组织队列，研究者评估了各方法区分这些空间差异的能力。他们使用随机森林分类器，基于各方法生成的NEP分数来区分不同的模拟队列。结果显示，所有方法都能有效区分队列，但使用连续分数（如Z值）的方法（如SEA、Misty、COZI）在区分弱与强偏好等细微差异时，表现优于使用分类分数（-1, 0, 1）的方法（如histoCAT、IMCRtools）。这表明连续分数能更好地表征NEP的强度。
利用条件计数平均解锁NEP方向性
在一个模拟了不对称细胞偏好（红色细胞更“喜欢”黄色细胞，而非反之）的数据集中，研究者检验了各方法捕捉方向性的能力。关键发现是，“条件”归一化是恢复方向性的决定性算法步骤。像histoCAT和本研究提出的COZI这样采用条件归一化的方法，能够成功捕捉到模拟的不对称偏好。而采用“整体”归一化的方法（如SEA、IMCRtools、Squidpy）则无法区分两个方向，给出了对称的分数。CellCharter、Misty和Scimap虽然能捕捉方向性，但其结果容易受到细胞类型丰度差异的影响。
通过条件细胞比率研究浸润模式的方向性
使用SpaSim模拟器生成细胞浸润场景（如一种细胞逐渐渗入另一种细胞的簇中），研究者比较了“整体”归一化（SEA）和“条件”归一化（COZI）的结果。SEA产生了全局的、无方向性的分数，而COZI能清晰地区分浸润方向（例如，是绿色细胞渗入紫色簇，还是相反）。为了辅助解读，研究者引入了“条件细胞比率”（Conditional Cell Ratio, CCR），用以量化对观测到的NEP分数有贡献的细胞比例，从而区分是广泛的浸润还是仅由一小部分细胞驱动。
恢复三阴性乳腺癌中的免疫-肿瘤细胞混合状态
将方法应用于真实的三阴性乳腺癌数据集，该数据已根据免疫-肿瘤细胞混合程度被分为“冷”、“混合”、“区隔化”三类肿瘤。COZI提供的方向性分数能够更细致地解读这些类别。例如，在冷和混合肿瘤中，COZI显示免疫细胞强烈避免与肿瘤细胞为邻，而只有少数肿瘤细胞偏好免疫邻居，这与视觉观察到的免疫细胞聚集成小簇、肿瘤细胞嵌入其中的现象一致。COZI的方向性分数成功地将样本聚类成一个从冷/混合到区隔化的梯度，提供了比SEA等全局分数更精细的机制性视角。
恢复心肌梗死数据集中的全局与局部组织结构
在心肌梗死数据集中，COZI是唯一能同时捕获中性粒细胞先于单核细胞浸润梗死核心，并能清晰呈现单核细胞通过心内膜层浸润方向性的方法。COZI分数结合CCR显示，在梗死后24小时，单核细胞对心内膜细胞表现出强烈的偏好，而心内膜细胞对单核细胞的偏好较弱，这精确反映了单核细胞从心内膜向心肌浸润的动态过程。相比之下，其他方法或无法捕捉方向性，或结果受细胞丰度影响较大。研究还验证了不同邻域定义（如Delaunay三角剖分、k近邻）对COZI结果影响较小，表明了其稳健性。
结论与讨论部分， 本研究首次对空间组学中广泛使用的细胞邻域偏好分析方法进行了系统性比较与优化。研究不仅揭示了现有方法的异质性与局限性，更重要的是明确了“灵敏度”和“方向性”是区分不同NEP方法性能的两个关键维度。研究者提出的条件Z值（COZI）方法，通过结合“条件”归一化和Z值计算，在模拟和真实数据中均展现出高灵敏度与卓越的方向性捕捉能力。配合条件细胞比率（CCR），COZI能够对复杂的组织浸润模式进行细粒度、可解释的分析，弥补了传统全局分析方法的不足。
这项研究的意义深远。首先，它为领域内的研究者和方法开发者提供了一份宝贵的“导航图”，帮助其根据具体的生物问题（是否需要方向性信息、细胞丰度是否均衡等）选择最合适的分析方法。其次，引入的COZI与CCR组合，为解决空间组学数据分析中的关键挑战——量化不对称的、具有生物学意义的空间模式——提供了强有力的新工具。这对于理解免疫细胞浸润、肿瘤微环境互作、组织发育与修复等动态过程至关重要。最后，研究展示了如何利用模拟数据框架（IST）进行空间组学方法的基准测试，为未来的方法学比较与开发设立了范例。尽管NEP分析主要适用于单细胞分辨率数据，且其基于全切片置换的统计假设存在局限性，但COZI为代表的新一代方法，朝着更准确、更可解释地量化组织空间结构迈出了坚实的一步，有望推动空间生物学发现向临床应用的转化。
