利用水热炭增强鸭粪的厌氧消化：通过双向厌氧消化-水热炭耦合技术探索绿色材料的潜力 李然 张新艳 徐晓辉 秦 Qingyu 范浩天 王志亮 王文龙

《Materials》：Enhancing Duck Manure Anaerobic Digestion with Hydrochar: Exploring Green Material Potential via Bidirectional AD-HTC Coupling Li Ren, Xinyan Zhang, Xiaohui Xu, Qingyu Qin, Haotian Fan, Ziliang Wang and Wenlong Wang

　　摘要 鸭粪和农业/林业废弃物（AFW）的有效资源利用在环境保护和促进经济及社会的可持续发展方面发挥着重要作用。本研究考察了来自AFW的水热碳（hydrochar）在厌氧消化（AD）过程中的效果，并确定了最佳添加比例。该研究系统地研究了水热碳对甲烷产量的影响，以及鸭粪厌氧消化过程中短链脂肪酸（SCFAs）的变化、微生物群落动态和代谢途径的变化。通过宏基因组学和代谢组学分析阐明了其背后的机制。实验中以鸭粪为底物，并添加了四种不同剂量的水热碳。实验室批量试验在37 ± 0.5 °C下进行了32天，每组设置了三个平行样本。结果表明，水热碳添加剂显著提高了甲烷产量（p < 0.05），在最佳添加量10.91 g·L?1时，甲烷产量增加了27.13%。这种改良剂显著增加了厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、绿弯菌门（Chloroflexota）、嗜盐菌门（Halobacteriota）和甲烷八叠球菌门（Methanosarcina）的丰度。与对照组相比，参与水解、产酸和产乙酸途径的功能基因在最佳处理组中的丰度增加了28–254%，与甲烷生成相关的基因丰度增加了16–155%（p < 0.05）。

1. 引言
2024年，中国的肉鸭产量达到了42.2亿只，占全球总产量的82%以上[1]。山东省泰安市是中国最大的肉鸭养殖基地，年肉鸭养殖量达21亿只[2]。根据每只肉鸭每天产生的粪便量0.259公斤计算，泰安市每年产生的鸭粪约为3000万吨。合理处理和利用大量鸭粪对泰安市肉鸭养殖业的可持续发展是一个紧迫的挑战。
肉鸭与其他家畜的粪便特性存在显著差异。鸭粪的特点是水分含量高、油脂含量高、氨氮含量高、粘度大且气味难闻[3,4,5]。这些特性决定了厌氧消化（AD）是处理鸭粪的最佳方法。然而，在鸭粪的AD过程中，常常会出现明显的抑制效应，伴随着高氮损失率、低能量转化率以及难以利用液体消化物。氨氮浓度在200–1500 mg·L?1范围内有利于甲烷生成[6]，而浓度约为2500 mg·L?1时则可能抑制甲烷生成菌[7]。在鸭粪的AD过程中，氨氮浓度可达到5000–6000 mg·L?1，氨的抑制作用会破坏代谢过程，降低能量转化效率，导致挥发性脂肪酸（VFAs）的积累，并影响甲烷的生成[8,9,10]。因此，在富含氮的底物的能量转化和循环利用过程中，加速AD过程以产生更多的沼气至关重要[11,12]。
最近的研究表明，诸如生物炭（biochar）、水热碳（hydrochar）和磁铁矿等外部添加剂可以加速AD过程。其中，水热碳是通过热解碳化（HTC）过程产生的固体[13,14,15]，它可以加速有机物水解[16,17]，改善产酸过程[18]，促进VFAs的降解[19,20]，并在AD过程中促进甲烷生成[21,22]。因此，由于其巨大的潜力，水热碳在AD过程中受到了广泛关注[23]。Hurst的研究[24]表明，来自酸水解的水热碳可以降低铵浓度并增加微生物多样性。最近的一项研究[25]发现，水热碳可以在死猪尸体的AD过程中去除氨并促进VFAs转化为沼气。Ren的研究[26]证明，水热碳可以促进氢化型甲烷生成和由乙酸生成的甲烷生成，这可能是由于直接的物种间电子转移（DIET）作用。
尽管多项研究证实了水热碳在AD中的有效性，但没有一项研究使用鸭粪作为底物，且不同研究中水热碳的最佳添加比例存在显著差异。Usman的研究[15]表明，在热液液化废水的AD过程中，10 g·L?1的水热碳可以增强甲烷产量。Sugiarto的研究[11]发现，在餐厨垃圾的AD过程中，15 g·L?1的水热碳可以增加甲烷产量。Yu的研究[27]指出，在餐厨垃圾的AD过程中，120 mg·L?1的生物炭可以实现最高的甲烷产量。因此，关于水热碳对鸭粪AD影响的最适添加比例仍需进一步实验确定。通过多孔缓释和功能团导电介质来促进抑制缓解和甲烷产量增强的机制也需要进一步研究。
基于以上情况，提出了一种通过HTC和AD双向耦合的创新思路，以处理鸭粪和其他高氮有机物。AD的液体消化物可以用作HTC过程中的液体载体，而水热碳可以用作添加剂来增强AD过程，旨在解决消化抑制、气体产率低和无法处理液体消化物等问题。
在本研究中，使用了鸭粪和来自AFW的水热碳作为原料，验证了基于双向耦合AD和HTC的技术的可行性，探索了水热碳的效果及其机制。该研究系统地研究了水热碳对甲烷产量、短链脂肪酸（SCFAs）的变化、微生物群落动态和鸭粪AD过程中代谢途径的影响。通过宏基因组学和代谢组学分析阐明了其背后的机制。

2. 材料与方法
2.1. 接种物和底物的制备与表征
接种物来自一个处理鸡粪的25 L实验室厌氧消化罐，该消化罐运行稳定且时间较长，随后迅速浓缩并转移到本实验中。新鲜的鸭粪来自中国泰安的新泰天心农牧发展有限公司，收集的是肉鸭立体养殖周期早期的粪便（第1-7天）。实验前，鸭粪在-24 °C的冰箱中储存不超过7天，以尽量减少有机物的降解和理化性质的变化。为了进一步减少潜在偏差，所有实验组使用的是同一批次储存的鸭粪。实验开始时，将冷冻的鸭粪解冻至室温并充分混合。鸭粪和接种物的主要特性总结在表1中。

2.2. 水热碳的制备与特性
2.2.1. 水热碳的制备
在本研究中，使用AFW作为水热碳的原料。实验前，先将树枝粉碎并研磨成颗粒。然后将这些生物质颗粒与水按1:9的质量比混合，转移到一个1000 mL的HTC反应器中；反应器由316不锈钢制成，配有自动温度控制系统和搅拌控制器。反应器以约5 °C·min?1的速率加热，保持在230 °C下1小时，搅拌速度为400 rpm，随后用冷却水冷却至室温。压力逐渐增加，最终达到2.3 MPa。然后使用真空过滤装置分离液体和固体产物。固体水热碳产品通过Retsch SM 300切割磨（Retsch GmbH，德国哈恩）和0.25 mm筛网插入物研磨至粒径小于0.25 mm，然后在35 °C下干燥24小时，并存放在玻璃密封瓶中。
表2显示了水热碳的化学和物理特性。本实验中水热碳的大比表面积高达123.88 m2·g?1，为AD过程中的微生物生长提供了充足的空间，有助于吸附铵和VFAs。水热碳的BET比表面积因所用材料类型而异。图1展示了水热碳的表面形态的SEM图像。从较低的放大倍数（图1a,b）可以看出，水热碳具有片状和准球形的形态。不同形态的水热碳堆叠在一起，形成了丰富的孔结构。进一步放大后，水热碳表面粗糙不平，有许多孔隙，从而具有较大的比表面积。水热碳的表面孔隙和功能团可以作为固定和富集功能微生物的位点，为与有机物水解、产酸和甲烷生成相关的功能细菌提供更多的栖息地和繁殖空间[24,28,29]，有利于甲烷生成。

2.3. 批量消化实验
批量实验在标称体积为500 mL的高硼硅玻璃瓶中进行，分为对照组和水热碳处理组。为了调整甲烷产量，C0组仅加入220 mL接种物作为空白组，C1组加入22 g鸭粪和220 mL接种物作为对照组。每个生物反应器的顶空间体积为363 mL。在水热碳组中，每个生物反应器加入22 g鸭粪和220 mL接种物。各组的F/M值为17.0。分别向每个生物反应器中加入0.06 g、0.12 g、0.24 g和0.36 g的水热碳，水热碳与鸭粪的比例分别为HC1、HC2、HC3和HC4组的2.73 g·L?1、5.45 g·L?1、10.91 g·L?1和16.36 g·L?1。
所有生物反应器都用丁基橡胶塞密封，用氮气冲洗四分钟，确保生物反应器内的氧气浓度低于0.5%，以维持厌氧环境。然后，将生物反应器放入装有搅拌器的空气浴中，保持120 rpm的转速，以确保消化温度稳定在37 ± 0.5 °C。批量AD实验持续约32天。每组设置三个平行样本以确保数据的可靠性。
沼气通过排水法收集，通过测量排出的水量来确定沼气体积。每4天取一次沼气样本，测量累积沼气产量和甲烷浓度。产生的沼气储存在气袋中。此外，每7天测定一次沼气成分和SCFAs的浓度。
每组甲烷产量的计算公式如下：
M?????4 = (M????????????×C?????4) / (M???????????? + M??????????×C?????4)
其中，M?????4是每组的日甲烷产量（mL·g?1 VS），Mbiogas是每组的日沼气产量（mL），Mbiogas,blank是空白组的日沼气产量（mL），CCH4是沼气中的甲烷体积浓度，Msubstrate是每组的底物重量。

2.4. 分析方法
水热碳的主要元素组成通过元素分析仪（SDCHN636，湖南三德科技有限公司，长沙）确定。水热碳的Mad、Aad、Vad和FCad通过工业分析仪（SDTGA6000，湖南三德科技有限公司，长沙）进行分析。水炭的平均孔径和比表面积是通过比表面积和孔径分析仪（JW-BK100，JWGB Sci. & TECH. Co., Ltd.，北京，中国）测量的。水炭的微观形态是使用热辅助场扫描电子显微镜（SEM）（Supra 55，Zeiss RMS，Oberkochen，德国）扫描的。水炭的表面官能团是通过傅里叶变换红外光谱仪（FTIR光谱仪）（Nicolet 6700，Thermo Fisher，Waltham，MA，美国）确定的。沼气产量是通过湿式流量计（LMF-1）（LMF-1，北京金志业仪器设备有限公司，北京，中国）测量的。气相色谱法（A91 Plus，常州市Panor仪器有限公司，常州，中国）用于测量沼气的组成。短链脂肪酸（SCFAs）的浓度是通过气相色谱法估算的，该方法配备了热导率检测器和氩气作为载气（30 mL·min?1）。柱温、进样器和检测器的温度分别为50 °C、150 °C和180 °C。挥发性固体（VS）和总固体（TS）的测量是使用APHA标准方法[33]进行的。

2.5. 元基因组分析
从C1、HC1、HC2、HC3和HC4在厌氧消化（AD）第12天获得的消化物样本用于元基因组测序和分析。选择第12天作为采样时间点是基于甲烷生产动力学，因为在这一阶段甲烷产量最高。这种时间安排使我们能够分析与甲烷生成高峰相对应的微生物群落和功能基因的丰度。为了确保分析数据的可靠性，每个样本进行了三次平行测试。
为了提取微生物 genomic DNA 样本，使用了 OMEGA Mag-Bind Soil DNA Kit（M5635-02）（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，美国）。DNA 的数量是通过 Qubit? 4 Fluorometer（WiFi: Q33238；Qubit? 1X dsDNA HS Assay Kit: Q33231；Qubit? Assay Tubes: Q32856）（Invitrogen，Carlsbad，CA，美国）进行评估的，并通过琼脂糖凝胶电泳来确定其质量。微生物 DNA 被切割成大约400 bp长度的片段。在中国上海的个人生物技术有限公司，样本被提取并通过 Illumina NovaSeq 平台（Illumina，San Diego，CA，美国）进行了鸟枪法测序。
原始测序读取结果经过处理，以获得用于进一步分析的质量过滤后的读取结果。首先，使用 Cutadapt（v1.2.1）[34] 从读取结果中去除测序接头。其次，通过 fastp（v0.23.2）中的滑动窗口算法修剪低质量读取。Kraken2（v2.0.8-beta）用于根据 GTDB 派生的数据库对元基因组测序读取结果进行分类[35]。Megahit（v1.1.2）被用来使用 meta-large 预置参数[36] 拼接每个样本的读取结果。长度大于300 bp的contigs使用 mmseqs2[37]在“easy-linclust”模式下进行合并和聚类，序列同一性阈值为0.95，且较短 contig 的覆盖率为90%。为了确定非冗余 contigs 的最低共同祖先分类，它们使用 mmseqs2 在‘taxonomy’模式下与 NCBI-nt 数据库对齐；被分类为 Viridiplantae 或 Metazoa 的 contigs 被排除在后续分析之外。基因预测是通过 Prodigal（V2.6.3）[38] 生成的。
所有样本的 CDS 序列使用 mmseqs2 软件在“easy-cluster”模式下进行聚类，蛋白质序列同一性阈值为0.95，较短 contig 的要求覆盖率为90%。为了评估这些基因的丰度，使用 Minimap2 将每个样本的高质量测序读取结果映射到预测的基因序列上，参数设置为“-ax sr --sam-hit-only”，并使用 featureCounts 来计算与基因序列对齐的读取数量，即每个基因的读取计数（RC）[39]。通过使用 mmseqs2 软件在“search”模式下搜索 KEGG 蛋白质数据库来注释非冗余基因的功能。

2.6. 统计分析
每项测量至少重复三次，数据以平均值 ± 标准差的形式呈现。使用 SPSS 25.0（IBM Corporation，Chicago，IL，美国）进行显著性差异分析（ANOVA）。对于微生物群落和功能基因的丰度，首先进行了 Kruskal–Wallis（KW）检验，然后对数据进行 log10 转换，并使用 Benjamini–Hochberg（BH）多重检验校正以减少直接使用相对丰度造成的假阳性影响。当 p 值 < 0.05（*）、p < 0.01（**）或 p < 0.001（***）时，两组之间存在显著差异。所有图表都是使用 OriginPro 2024（OriginLab Corporation，Northampton，MA，美国）制作的。

3. 结果与讨论
3.1. 水炭对鸭粪厌氧消化的影响
3.1.1. 水炭对甲烷产量的影响
图3显示了五个组（不包括仅含 C0 的组）在32天厌氧消化过程中的累积甲烷产量。扣除接种物（C0）的影响后，C1、HC1、HC2、HC3 和 HC4 的累积甲烷产量分别为 138.17 ± 3.99、149.95 ± 2.62、161.52 ± 3.89、175.65 ± 1.84 和 158.17 ± 3.83 mL·g?1 VS。HC3 的甲烷产量最高（175.65 mL·g?1 VS），比 C1 高出27.13%。添加水炭后，甲烷产量显著高于对照组（p < 0.05），这证明了水炭对甲烷生成的促进作用。水炭的最佳剂量与 Usman[15] 和 Sugiarto[11] 报告的剂量大致一致。Shen[40] 提到，甲烷含量的增加可能是由于水炭表面的功能菌群将 VFA 和乙醇转化为甲烷，并且水炭的碱性有助于维持厌氧消化的理想 pH 值。甲烷产量最初随着水炭剂量的增加而增加，但随后由于过量添加而下降，这与 Choe[18] 和 Xu[25] 的观察结果一致。假设过量的水炭在沼气生成之前吸附了额外的 VFAs，从而减少了甲烷生成的可用底物。此外，更多的水炭颗粒附着在底物表面，减少了产甲烷细菌与底物之间的接触面积[25]。

3.1.2. 水炭对厌氧消化过程中 SCFAs 浓度和组成的影响
图5显示，在鸭粪厌氧消化过程中，水炭显著影响了 SCFAs 的浓度和组成。与 C1 相比，水炭在3到24天内增加了 SCFAs 的浓度，这可能是由于促进了水解和酸生成过程。在25到32天之间，有机物的消耗几乎完成，水炭最终降低了总 SCFAs 的浓度。
图4展示了所有五个组在32天厌氧消化过程中的每日甲烷产量（p < 0.05）。所有组的每日甲烷产量变化趋势相似，最初增加（4-12天），然后减少（12-28天），在最后阶段（28-32天）所有组的每日甲烷产量接近0。所有组的甲烷产量在第12天达到峰值。与其他组相比，HC2 和 HC3 中的水炭剂量有利于甲烷生产的最佳可持续性。当水炭加入厌氧消化系统时，其较大的比表面积和发达的多孔结构建立了一个三维支架，为产甲烷古菌提供了扩展的栖息地，从而导致了甲烷生成速率的快速增加。

3.1.3. 水炭对有机物降解的影响
最初的 F/M 比值表明底物供应相对充足，为产甲烷菌提供了丰富的代谢底物。由于所有组使用相同的 F/M 比值，因此排除了底物负荷差异作为干扰实验结果的因素。图6显示了有无水炭的所有组的 VS 降解率。C1 的 VS 降解率为66.62%，而 HC1、HC2、HC3 和 HC4 的 VS 降解率分别为69.21%、72.32%、73.95%和71.69%，比 C1 高出3.88~11.00%。随着水炭的添加，VS 降解率增加，在 HC3 中达到最大值。然而，当添加过量的水炭时，HC4 的 VS 降解率下降。
因此，水炭可以有效增强 VS 的降解，从而增加甲烷产量。VS 降解率从高到低的顺序与甲烷产量一致，表明 VS 降解效率与甲烷产量之间存在强正相关。

3.2. 微生物群落的变化
3.2.1. 微生物群落的多样性
所有样本的原始读取总数范围从 8.97 × 107 到 1.35 × 108。经过质量过滤后，每个样本获得了 8.91 × 107 到 1.34 × 108 个清洁读取结果，平均每个样本有 1.34 × 108 个清洁读取结果。平均测序深度足以进行元基因组分箱分析，所有样本的有效测序覆盖率范围为98.53%到99.31%，表明测序数据质量符合后续微生物基因组重建、群落组成和功能注释分析的要求。
添加水炭显著改变了微生物群落结构（图7）。Chao 指数（图7a）显示水炭组的群落丰富度高于 C1。Simpson 指数（图7b）和 Shannon 指数（图7c）显示，随着水炭的添加，群落多样性和丰富度显著降低且范围扩大，这可能是由于群落结构的变化。如图7d所示，基于 Bray–Curtis 距离进行了 ADonis 分析来测试组间差异，结果表明组间没有显著差异。这两个坐标贡献了总方差的80%以上（PCo1 75.2% 和 PCo2 10%），研究显示水炭组和对照组有显著分离，表明水炭的添加对微生物种群施加了选择压力。

3.2.2. 微生物群落结构
所有宏基因组（MAGs）都经过了 CheckM v1.1.3 的基因组完整性和污染评估。选择完整性 ≥ 50% 和污染 < 10% 的 MAGs 进行后续分析。结果中报告的所有 MAGs 均符合筛选标准。共有 144 个 MAGs 被注释为物种，140 个 MAGs 被识别为细菌并归类为 17 个门，4 个 MAGs 被识别为古菌并归类为 2 个门，这是根据 GTDB-tk 注释结果确定的。所有组别消化物中的微生物群落在图8中得到了表征，详细数据见表S1。Kruskal–Wallis（KW）检测结果显示，在这五组之间微生物的丰度没有显著差异。图8显示了微生物群落的分析：（a）门水平上前10种细菌的相对丰度；（b）属水平上前15种细菌的相对丰度；（c）门水平上古菌的相对丰度；（d）属水平上前10种古菌的相对丰度。显著性用“ns”表示：无显著性。

如图8a所示，所有组中的细菌组成主要由五个门组成：厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、绿弯菌门（Chloroflexota）、滑稽单胞菌门（Cloacimonadota）和变形菌门（Proteobacteria）。厚壁菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和变形菌门在水解和产酸过程中发挥着重要作用[42,43]。在氢炭组中，厚壁菌门的相对丰度范围为37.15%至40.57%，而在C1组中最低，为32.97%。拟杆菌门的相对丰度在HC3组中达到峰值30.81%，而在C1组中最低，为23.01%。绿弯菌门的相对丰度在氢炭组中范围为7.49%至8.25%，而在C1组中最低为5.18%（p < 0.05）。厚壁菌门是早期发酵阶段的初级降解者，负责将各种糖类和碳氢化合物降解为甲烷前体物质，如乙酸、H2和CO2，从而成为水解和甲烷生成过程之间的关键连接[44]。据报道，拟杆菌门具有降解含氮和酚类有机物的能力[45]，可以分解糖类和氨基酸，产生琥珀酸和乙酸[46,47]。此外，先前的研究[48,49]还记录了绿弯菌门在DIET中作为可能的电活性细菌伙伴促进甲烷生成的功能，而氢炭组中绿弯菌门丰度的增加暗示了其可能与DIET相关过程有关。

为了更深入地了解氢炭引起的微生物群落变化，我们在属水平进行了分析。属于拟杆菌门的Dysgonomonadaceae科的细菌g_UBA4179、属于厚壁菌门的Saccharofermentanale目的细菌g_UBA4923以及属于绿弯菌门的Anaerolineaceae科的细菌g_T78是在氢炭组中丰度最高的三个属，尤其是在HC3组（图8b）。它们在水解和产酸过程中都起着关键作用，其在氢炭组中的高丰度可以解释VS的快速降解，这与AD前期甲烷的快速生成相关。

如图8c所示，属于盐杆菌门（Halobacteriota）的古菌在所有组中占主导地位，其相对丰度在HC3组中达到峰值90.75%，在C1组中最低为85.04%。根据[50]的研究，含有b型细胞色素的盐杆菌门甲烷生成菌比缺乏b型细胞色素的甲烷生成菌具有更高的生长产量，并能利用更广泛的底物。盐杆菌门的丰度可能解释了氢炭组中观察到的甲烷产量增加，表明这一门的丰度与甲烷生成能力之间存在潜在关联。

如图8d所示，氢炭组中的甲烷生成菌比C1组更多，Methanosarcina的丰度更高，而Methanoculleus的丰度较低。氢炭组中Methanosarcina的相对丰度提高到30.99–39.18%，而C1组中为27.13%（p < 0.05）。作为乙酸裂解型甲烷生成菌，Methanosarcina可以直接利用乙酸生成甲烷，而Methanoculleus是氢营养型，依赖H2/CO2底物。Methanoculleus丰度的降低可能减少了氢营养途径的底物竞争，间接促进了乙酸裂解途径的主导地位。Methanosarcina是一种能够利用多种底物（包括H2、CO、乙酸、甲酸和甲胺）生长的甲烷生成菌[51,52]，在整个AD过程中占主导地位。氢炭组中Methanosarcina的丰度增加暗示了该属可能在DIET相关的电子转移中起作用[53]；然而，需要进一步探索宏基因组证据来确认其活性。其高丰度可能加速乙酸向甲烷的转化，有效防止乙酸积累和酸化抑制，这与乙酸积累减少和甲烷产量增加具有正相关，表明其在缓解酸化抑制方面具有潜在作用。此外，Methanosarcina可以通过代谢调节适应高氨氮和高有机负荷的环境[52,54]。氢炭组中Methanosarcina的高丰度暗示其可能适应了鸭粪AD中的高氨氮环境；然而，需要进一步研究乙酸裂解酶的实际代谢活性。

3.3. 代谢途径及相关功能基因
3.3.1. 水解、产酸和乙酸生成途径相关基因的分析
在水解过程中，鸭粪中的蛋白质和脂质被分解为氨基酸和葡萄糖，这些物质通过产酸过程进一步转化为各种酸类。随后，含有丙酮酸、丁酸和丙酸的各种酸通过乙酸生成过程被分解为乙酸（图9）。详细数据见表S2。基于Kruskal–Wallis（KW）检测，图9 display 了显著差异（显著性p < 0.05；ns：无显著性）。首先，氢炭增强了所有参与糖酵解过程的功能基因的丰度，除了gpmB和pfkC。与C1相比，HC3中大多数与糖酵解相关的基因的绝对丰度显著增加，范围从12%到102%。基因pps和ppdK参与糖酵解途径中的底物激活；pyk和ENO是糖酵解的核心催化酶；gpmA和pgk负责糖酵解过程中的能量和物质运输。基因丰度的增加表明碳水化合物水解能力增强，中间代谢产物的产量提高。

此外，氢炭还增加了氨基酸代谢相关功能基因的绝对丰度。HC3中这些基因的丰度从11%增加到55%，是所有氢炭组中最高的（图9）。氨基酸的代谢过程不仅产生了核心甲烷生成底物（如乙酸和丙酸），还调节了系统pH值并维持了代谢平衡[55]。HC3组中这些基因的协同上调增强了通过氨基酸降解提供多样化甲烷生成底物的潜力。

酸化阶段主要包含丙酮酸、丙酸和丁酸的代谢，是连接水解和甲烷生成的关键环节，为甲烷生成代谢提供了必要的底物和能量支持。丁酸是AD的一个关键中间产物，可以进一步转化为乙酸用于甲烷生成。atoA/B/D基因编码乙酰辅酶A转移酶（参与短链脂肪酸的运输/代谢），crt和bcd调节脂肪酸β-氧化，ptb和buk编码磷酸转丁酸激酶和丁酸激酶（丁酸合成的关键酶）。这些基因在HC3中的协同上调不仅提高了脂肪酸向丁酸转化的效率，还促进了丁酸通过β-氧化途径转化为乙酸的潜力。这种双重机制可能增加了甲烷生成的核心底物供应，同时避免了过量VFAs积累造成的毒性抑制。氢炭组中Methanosarcina的丰度增加表明其可能在DIET相关的电子转移中起作用[53]；然而，需要进一步探讨宏基因组证据以确认其作用。其高丰度可能加速乙酸向甲烷的转化，有效防止乙酸积累和酸化抑制，这与乙酸积累减少和甲烷产量增加呈正相关，表明其在缓解酸化抑制方面具有潜在作用。此外，Methanosarcina可以通过代谢调节适应高氨氮和高有机负荷的环境[52,54]。氢炭组中Methanosarcina的高丰度表明其可能适应了鸭粪AD中的高氨氮环境；然而，需要进一步研究乙酸裂解酶的实际代谢活性。

3.3.2. 甲烷生成途径相关基因的分析
甲烷生成途径主要包括两种类型：氢营养型甲烷生成和乙酸裂解型甲烷生成。基于KEGG数据库的主要甲烷生成途径和关键基因见图10，数据见表S3。基于Kruskal–Wallis（KW）检测，图10显示了显著差异（显著性p < 0.05；ns：无显著性）。特别是，HC3中acs、cdhD、pta和 ackA的丰度分别增加了45.0%、30.1%、44.1%和51.6%（图10）。与C1相比，氢炭通常上调了核心氢营养型甲烷生成基因的丰度，包括mer、mtd和mch以及甲酰甲基呋喃脱氢酶复合体的亚单位（fwdA、fwdB、fwdC、fwdE）。所有这些基因的丰度在HC3中达到峰值；其中，mer、mtd和fwdB在HC3中的增幅范围为199.0%至112.8%，而其他基因的增幅为9%至87.3%。这一发现表明参与氢营养型甲烷生成初始步骤的关键基因的丰度显著增加，表明CO2转化为甲酰甲基呋喃的代谢潜力更高。

此外，介导甲烷生成下游步骤的mer在HC3组中也表达了最高水平，进一步支持了高效的甲烷生成。总体而言，这些结果表明，应用于HC3的氢炭剂量有效地上调了参与氢营养型甲烷生成途径的关键基因的丰度。这些关键基因丰度的增加可能有助于提高底物利用效率和电子传递效率，这最终解释了HC3中观察到的最高甲烷产量。

Mcr和hdr是甲烷生成过程中的关键基因，在将甲基辅酶M转化为甲烷的过程中起关键作用。与C1相比，氢炭组中mcrA和mcrB的丰度显著增加（p < 0.01），hdrA1和hdrA2在HC3中的丰度也显著增加（p < 0.01）。在HC3组中，mcrA和mcrB的丰度增加了2.1–2.2倍，而hdrA2和hdrB2的丰度增加了1.2–1.3倍。结果显示，终端甲烷生成步骤（mcrA/mcrB）对氢炭的响应比电子传递系统（hdrA2/hdrB2）更敏感。这些关键甲烷生成基因的丰度增加与HC3中最高的甲烷产量呈正相关。

结果表明，氢炭增加了参与乙酸裂解型和氢营养型甲烷生成途径的功能基因的丰度，表明这些基因丰度的变化与水解、产酸和乙酸生成途径的代谢潜力提升相关，这些基因丰度的变化与AD性能的改善（更高的VS降解、高效的SCFA消耗和更高的甲烷产量）正相关。

3.4. 限制和未来研究方向
需要注意的是，本研究仅进行了宏基因组分析，研究结果在反映氢炭对AD中微生物群落组成和相关功能基因分布方面具有一定的代表性。然而，没有进行宏转录组学分析，因此从微生物和功能基因丰度增加推断出的潜在DIET机制不能作为甲烷产量增加的因果因素得到证实。未来的研究需要结合宏转录组学来确认微生物的实际代谢活动、功能基因在转录本/蛋白质水平的表达，以及饮食（DIET）与添加了水热炭（hydrochar）的鸭粪厌氧消化（AD）系统中甲烷生成增强之间的因果关系。本研究主要探讨了水热炭对微生物结构和功能基因丰度的影响，但没有对厌氧消化过程中的碳流进行系统的测量和分析。因此，本研究无法量化水热炭对甲烷碳、二氧化碳碳、液态碳和固态碳的具体影响。所以，水热炭通过调节碳流促进厌氧消化的机制仍需进一步研究。本研究的另一个局限性是采用单时间点采样策略。尽管第12天代表了甲烷产量的峰值阶段，但通过多个时间点采样的未来研究将能够更全面地了解整个厌氧消化过程中微生物群落结构和功能的动态变化。作为一项批处理规模的研究，本研究具有固有的局限性。目前正在进行进一步实验，以研究水热炭在连续中试规模厌氧消化系统中的性能，以提高研究结果的实用性和普遍性。此外，不同类型的水热炭（例如，由不同原料制成或在不同的水热炭化（HTC）条件下制备）对鸭粪厌氧消化的影响，以及在不同有机负荷率下的影响，也需在未来的研究中系统地进行探讨。

4. 结论
本研究探讨了来自农业废弃物（AFW）的水热炭在鸭粪厌氧消化中的机制。在水热炭的添加下，鸭粪厌氧消化的甲烷产量最多增加了27.13%，促进了短链脂肪酸（SCFAs）的消耗，从而加快了甲烷的生成速度。当水热炭的添加量为10.91 g·L?1时，甲烷产量最高。甲烷产量最初随着水热炭添加量的增加而增加，但随后因过量添加而下降。宏基因组分析显示，不同组别中微生物和关键酶的丰度增加与相应的甲烷生成一致。水热炭显著增加了厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）和绿弯菌门（Chloroflexota）的相对丰度，这些微生物在水解和酸化过程中起着关键作用，这些门类在水热炭组中的丰度升高表明它们在鸭粪水解和酸化阶段具有更高的潜力。水热炭的添加还增加了嗜盐菌门（Halobacteriota）和甲烷硫菌属（Methanosarcina）的丰度，这两种微生物是甲烷生成的核心类群。此外，参与水解、酸化、乙酸生成和甲烷生成途径的关键功能基因在水热炭组中的丰度显著增加，其中HC3组中的水平最高，这表明这些关键厌氧消化途径在水热炭组中的代谢潜力更强。

该实验验证了将水热炭化与厌氧消化双向耦合的创新想法的可行性，确定了水热炭的最佳添加量，并通过宏基因组分析探讨了其促进机制。水热炭可能通过重塑微生物群落结构和提高关键厌氧消化途径的功能基因丰度来增强甲烷生成。提出的饮食效应作为一种潜在的机制，需要进一步验证。这项技术为解决鸭粪厌氧消化中低沼气产量问题提供了一种有前景的方法，同时也为沼气液体的利用提供了可能的途径。

补充材料
以下支持信息可供下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/ma19081563/s1
- 表S1：细菌和古菌群落的相对丰度，(a) 门水平上排名前10的细菌的相对丰度，(b) 属水平上排名前15的细菌的相对丰度，(c) 门水平上古菌的相对丰度，(d) 属水平上排名前10的古菌的相对丰度；
- 表S2：水解、酸化和乙酸生成途径及相关基因；
- 表S3：甲烷生成途径及相关基因。