组合代谢工程使得在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中高效地将橙皮苷（hesperidin）转化为新橙皮苷（neohesperidin）成为可能

《Biochemical Engineering Journal》：Combinatorial metabolic engineering enables efficient bioconversion of hesperidin into neohesperidin in Bacillus subtilis

合成生物学方法通过CRISPR-Cas9敲除枯草芽孢杆菌内源β-葡萄糖苷酶基因，并表达异源糖基转移酶体系，成功构建了从hesperidin到neohesperidin的高效生物转化通路，最终实现转化率75.45%和产量652.84 mg/L的突破。

　　

王永杰|陈静|程敬生|赵广荣

合成生物学国家重点实验室，合成生物学前沿科学中心（教育部），天津大学合成生物学与生物制造学院，中国天津市津南区雅观路135号，300350

摘要

新橙皮苷是一种具有广泛应用价值的黄酮苷类化合物，在食品工业中具有重要意义。目前，新橙皮苷主要通过化学半合成方法进行工业生产，但该方法转化效率较低。为了提高新橙皮苷的产量，研究人员利用CRISPR-Cas9系统破坏了枯草芽孢杆菌中的内源性β-葡萄糖苷酶基因。结果，工程菌株中橙皮苷7-O-葡萄糖苷的残留浓度比野生型高出了33.05%。将Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482来源的α-鼠李糖苷酶（BtRha）、Vitis vinifera来源的UDP-鼠李糖合成酶的N端区域与Arabidopsis thaliana来源的双功能UDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖3,5-异构酶/UDP-4-酮-鼠李糖4-酮还原酶的C端区域融合而成的RHDER酶，以及Citrus maxima来源的1,2-鼠李糖转移酶（RHAT）异源表达在枯草芽孢杆菌中，使得橙皮苷的转化率达到了48.06%。为进一步提高转化效率，研究人员优化了糖供体UDP-鼠李糖（UDP-Rha）的合成，并通过转录组测序筛选了适合枯草芽孢杆菌的天然启动子来调控RHDER和RHAT的表达。通过分批补料策略进一步优化了生物转化过程。最终，工程菌株的新橙皮苷产量达到了652.84 mg/L，转化率为75.45%。这些结果表明，代谢工程策略为微生物生产多种黄酮苷类化合物提供了宝贵的方法。

引言

黄酮类化合物是一大类广泛存在于水果、蔬菜、草药和其他农作物中的天然产物[1]、[2]。这类化合物具有多种药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌和抗病毒作用[3]、[4]、[5]。新橙皮苷（橙皮苷7-O-新橙皮苷）是一种常见的黄酮苷类化合物，其A环的7位羟基与新橙皮糖（鼠李糖-α-1,2-葡萄糖）相连。新橙皮苷具有多种生物活性，在食品和制药领域具有广泛应用潜力[6]。更重要的是，新橙皮苷可通过催化氢化反应转化为新橙皮苷二氢查尔酮[7]。新橙皮苷二氢查尔酮是一种安全、低热量的甜味剂，其甜度是蔗糖的1500–1800倍，而热量仅为蔗糖的千分之一到两千分之一[8]、[9]。由于其优异的甜味特性和掩盖苦味的功效，新橙皮苷在食品和饮料行业得到了广泛应用。

传统上，新橙皮苷可以通过与柚皮苷和异香豆素进行化学半合成来制备。在碱性条件下，柚皮苷裂解生成4’-新橙皮苷酚酮，后者再与异香豆素缩合生成新橙皮苷[10]。然而，这种方法转化效率较低且对环境不友好。从Aurantii Fructus中提取新橙皮苷需要使用有机溶剂，但由于植物中新橙皮苷的含量较低，这种方法的实际应用受到限制[11]。合成生物学和代谢工程为高价值天然产物的生物合成提供了有前景且可持续的方法[12]、[13]、[14]。在烟草和胡萝卜细胞悬浮培养中，通过表达1,2-鼠李糖转移酶基因，可以将前体橙皮苷-7-O-葡萄糖苷转化为新橙皮苷[15]。黄酮类的鼠李糖化反应需要供体UDP-鼠李糖（UDP-Rha），该物质可由UDP-葡萄糖（UDP-Glc）通过三功能UDP-鼠李糖合成酶合成。研究人员利用由Vitis vinifera来源的UDP-鼠李糖合成酶的N端区域与Arabidopsis thaliana来源的双功能酶组成的融合酶，在体外和大肠杆菌中实现了槲皮素向槲皮素3-O-鼠李苷的鼠李糖化[16]、[17]。类似地，也有报道指出可以在体外将橙皮苷-7-O-葡萄糖苷转化为新橙皮苷[18]。最近，通过异源表达UDP-鼠李糖合成酶和糖转移酶基因，工程化的酿酒酵母和大肠杆菌能够从橙皮苷前体合成多种黄酮苷类化合物[19]、[20]。然而，能够将橙皮苷高效转化为新橙皮苷的工程化微生物细胞工厂尚未得到充分开发。

枯草芽孢杆菌已被认定为“普遍认为安全”（GRAS）菌株，已被广泛用于生产工业酶[21]、[22]、核黄素[23]、表面活性剂[24]和丙酮醛[26]。最近，通过表达糖转移酶，枯草芽孢杆菌还被用于通过糖基化反应生产槲皮素3-O-葡萄糖苷[27]。这些成就进一步证明了枯草芽孢杆菌作为黄酮苷类化合物生产平台的多样性和可靠性。在本研究中，通过组合代谢工程构建了重组枯草芽孢杆菌菌株，实现了橙皮苷向新橙皮苷的高效转化（图1）。首先，敲除了编码β-葡萄糖苷酶的内源基因以减少黄酮苷类的降解；随后利用CRISPR-Cas9系统构建了从橙皮苷到新橙皮苷的生物转化途径，并优化了UDP-Rha的合成途径；最后通过转录组引导的启动子工程调控了相关基因的表达，从而提高了转化效率。据我们所知，这项工作展示了在枯草芽孢杆菌中通过合理设计的代谢途径实现新橙皮苷微生物生产的可行性，为黄酮苷类化合物的生物合成提供了通用框架。

菌株与试剂

本研究中，大肠杆菌 turbo菌株被用作质粒构建和储存的宿主菌株，购自北京Biomed Gene科技有限公司。枯草芽孢杆菌 168菌株作为所有工程菌株的起始菌株。本研究使用的枯草芽孢杆菌菌株列于表S1中，所用质粒列于表S2中。

橙皮苷（纯度98%）和新橙皮苷（纯度98%）购自天津Heowns Biochem公司。橙皮苷7-O-葡萄糖苷（纯度98%）也来自同家公司。

新橙皮苷生物转化途径的构建

先前的研究已鉴定出bglA、bglC和bglH基因，这些基因编码枯草芽孢杆菌中的β-葡萄糖苷酶[30]、[31]、[32]。为了测试枯草芽孢杆菌对黄酮苷类的降解能力，分别向培养基中添加了橙皮苷、橙皮苷7-O-葡萄糖苷和新橙皮苷。发酵过程中，橙皮苷和新橙皮苷未发生明显降解，而橙皮苷7-O-葡萄糖苷的浓度显著降低。

结论

总结而言，本研究利用CRISPR-Cas9系统在枯草芽孢杆菌 168菌株中建立了从橙皮苷到新橙皮苷的生物转化途径。通过过表达内源基因并删除竞争性基因，优化了UDP-Glc的合成途径，BNH13菌株产生了117.17 mg/L的新橙皮苷，转化率为65.35%。随后通过转录组测序分析了天然启动子的活性，并筛选出三个合适的启动子以进一步优化转化效率。

CRediT作者贡献声明

赵广荣：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取、数据分析、概念构思。程敬生：方法设计、数据分析。陈静：数据验证与整理。王永杰：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法设计、实验设计、数据分析、概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号22527901）的支持，同时也得到了广东省重点研发计划（项目编号2020B0303070002）和海河可持续化学转化实验室（项目编号24HHWCSS00006）的资助。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本研究结果的财务利益冲突。