快速溶解的微针，其针尖涂有卵白蛋白，用于经皮过敏原特异性免疫疗法

《International Journal of Biological Macromolecules》：Fast-dissolving microneedles with tip-loaded ovalbumin for transcutaneous allergen-specific immunotherapy

本研究开发了一种基于透明质酸的快速溶解微针阵列（OVA-MN），通过经皮递送过敏原ovalbumin至表皮朗格汉斯细胞和真皮树突状细胞，实现免疫耐受并减少全身副作用。实验优化了材料配比以平衡机械性能和溶解效率，在3周内仅需75微克剂量即可显著改善过敏小鼠模型的肺功能及IgE水平，展现出高效、便捷的经皮免疫疗法优势。

　　

王震|朱晓红|苗张毅|刘凡明|周建平|梅东|丁阳

中国药科大学药学院天然药物国家重点实验室，中国南京同家巷24号，210009

摘要

过敏原特异性免疫疗法（AIT）的普及受到频繁给药和长时间治疗带来的高不良反应风险的阻碍。考虑到表皮和真皮区域中大量的抗原呈递细胞，我们提出了一种经皮AIT策略，以实现脱敏并预防过敏反应。通过两步铸造法制备了基于透明质酸（HA）的快速溶解微针阵列，其中针尖被包裹了卵清蛋白过敏原（OVA-MN）。聚合物-添加剂复合物的组成经过优化，以平衡机械性能和降解效率，从而制备出能够高效穿透皮肤、减少给药时间和次数的OVA-MN阵列。一旦插入皮肤，OVA-MN阵列会迅速溶解，并在表皮和真皮层释放精确剂量的OVA，从而产生可靠的免疫重塑效果。与传统的皮下注射相比，仅需要在3周内给予总共75微克的剂量，就能改善过敏性哮喘小鼠模型中的过敏原特异性IgE反应并改善肺功能，这证明了OVA-MN在安全水平上具有节省抗原剂量和时间的潜力。总体而言，本文描述的OVA-MN阵列为过敏治疗提供了一种创新方法，具有方便的给药方式和令人满意的治疗效果。

引言

免疫球蛋白E（IgE）介导的过敏影响了超过50%的学龄儿童，这对全球医疗和经济都构成了重大挑战[1]。过敏原特异性免疫疗法（AIT）通过建立过敏原耐受性来抑制不希望出现的Th2反应，是目前唯一可改变疾病进程的治疗方法[2]。临床上，皮下免疫疗法（SCIT）是首选的AIT方法，需要在3-5年内进行50-80次过敏原注射，但存在依从性差、安全性低以及局部或全身副作用风险高的问题。因此，目前只有不到5%的患者将AIT作为二线治疗手段[3]。为了克服传统AIT的局限性，迫切需要探索能够提供长期过敏原保护效果的个性化治疗方法，目标是优化过敏原的吸收和呈递给免疫系统的过程，从而最小化全身副作用，并开发出方便的给药策略，最好是自我给药[4]。 皮肤是一个具有高度免疫活性的器官，其中含有丰富的免疫细胞，在接触过敏原后能迅速启动抗原处理和免疫信号传导[5]。功能上，角质形成细胞作为前线哨兵，能够检测危险信号并分泌细胞因子，而朗格汉斯细胞（LCs）和真皮树突状细胞（DCs）作为专业的抗原呈递细胞（APCs），负责捕获、处理抗原并将其运输到引流淋巴结（dLNs）。同时，驻留和循环的T细胞整合这些信号，以支持有效的T细胞激活和适应性免疫反应[6]。在这种背景下，针对皮肤的AIT成为一种有前景的治疗手段。通过利用表皮中LCs的先天免疫能力，表皮免疫疗法（EPIT）通过局部应用过敏原来诱导耐受性，满足了无针和自我给药的需求[7]。然而，角质层（SC）阻碍了过敏原通过完整皮肤的传递，表明在临床试验中还有很大的改进空间[5]。此外，自上而下的局部给药方式只能在表皮中保留少量过敏原用于LCs靶向，而忽略了真皮DCs的抗原呈递作用，从而无法诱导更强的免疫反应。因此，经皮免疫疗法能够实现LCs和真皮DCs的协同效应，将足够且精确的过敏原剂量传递到皮肤的局部免疫微环境中。 微针（MN）是一种微米级的针阵列，用于实现活性物质的微创经皮给药[8]。值得注意的是，长度在50微米到1000微米之间的微针可以有效将过敏原传递到表皮和真皮，这两个部位含有大量的LCs和真皮DCs，为诱导过敏原特异性免疫反应创造了有利条件[9][10]。在早期研究中，使用了镀层的不锈钢微针阵列来改善过敏原在皮肤中的传递[11][12][13]。这些研究表明，在呼吸系统和食物过敏的小鼠模型中，镀层微针具有治疗和预防作用[14][15]。尽管金属微针平台具有可靠的皮肤穿透能力，但聚合物微针作为一种有前景的替代品正逐渐受到关注，因为它们具有更好的载药能力、易于制造和处理，以及材料供应充足[8][16]。透明质酸（HA）是一种天然存在的多糖，具有优异的生物相容性和生物安全性，在涉及可溶解微针的临床试验中应用率超过53%[17]。制造过程中无需加热步骤或有机溶剂，确保了药物的稳定性，尤其是对于蛋白质过敏原[18]。然而，高分子量的HA虽然具有更好的渗透性，但会导致溶解时间超过60分钟[19]。因此，平衡快速降解和机械强度是实现高效药物传递和减少给药时间的关键，这对于患者尤其是自我给药者来说非常重要。 在这项研究中，我们开发了能够同时将过敏原传递给表皮LCs和真皮DCs的快速溶解微针，以诱导对过敏的免疫耐受性。这些生物相容性的微针使用市售的HA制备，针尖通过两步铸造法包裹了卵清蛋白（OVA）过敏原，制成带尖端负载的微针阵列（OVA-MN）。快速溶解的添加剂包括6种糖类和聚合物，被加入HA基质中，以同时满足机械性能、快速降解和可控释放动力学的要求。为了合理设计，选择了精氨酸（Arg）作为最佳崩解剂，并与不同比例的聚合物-添加剂复合物结合，以平衡机械性能和降解效率。所得到的OVA-MN阵列经过物理形态、机械性能、插入能力和释放特性的检测。在过敏性哮喘小鼠模型中，一旦插入皮肤，OVA-MN阵列能够迅速溶解并在表皮和真皮层释放精确剂量的OVA，从而产生安全可靠的免疫重塑效果。总体而言，本文描述的OVA-MN阵列在减少给药时间和次数方面具有显著优势，为过敏治疗提供了可靠且方便的方法。

材料

透明质酸（HA，220 kDa）和寡聚透明质酸（oligo-HA，3 kDa）来自山东银河生物科技有限公司（济南，中国）。聚乙烯醇（PVA 1788）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP K17，PVP K60）、精氨酸、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、羟乙基哌嗪乙烷磺酸（HEPES）和亚甲蓝购自麦克林生化有限公司（上海，中国）。卵清蛋白（V级）和Dispase II来自西格玛-奥德里奇公司（美国）。Imject? Alum

结果与讨论

在这项研究中，我们开发了快速溶解的微针（MN），作为一种无痛且有效的工具，用于将过敏原沉积到皮肤中。在OVA-MN中加入添加剂，实现了机械性能和降解之间的平衡，从而在减少给药时间的同时提高了经皮过敏原传递的效果。我们详细研究了最佳尖端负载OVA-MN的物理特性，随后进行了比较

结论

过敏病的普遍性促使人们广泛研究针对呼吸系统或食物过敏的创新AIT方法。新兴的过敏原传递方式强调无针给药方式，这要求更高的安全性。在这项工作中，我们首次提出了快速溶解的微针作为一种无痛且有效的方法，用于将过敏原沉积到表皮和真皮中。本研究中使用的生物相容性微针由HA制成，并加入了特定的成分

CRediT作者贡献声明

王震：撰写原始稿件、方法学设计、资金获取、数据管理、概念构思。 朱晓红：验证、方法学设计、数据分析。 苗张毅：撰写原始稿件、数据管理。 刘凡明：验证、方法学设计。 周建平：可视化处理、监督。 梅东：监督、项目管理、资金获取。 丁阳：撰写与编辑、资源协调、项目管理、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（82372113、82404521）、国家青年****、浙江省自然科学基金（LQ24H300002）、江苏333高层次人才培训项目（[2022] 3-16-190）以及嘉兴医学重点学科（2023-ZC-008）的支持。本研究得到了药用植物功能与应用国家重点实验室项目的资助