《Frontiers in Oncology》：High-throughput screening to engineer optimal T cell therapies: current knowledge and future prospects
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过继性T细胞疗法（Adoptive T cell therapy, ACT）是癌症免疫治疗的一种有效策略，但其临床疗效常受原发性耐药限制。为克服这一挑战，高通量筛选技术已成为优化ACT的重要工具。通过从海量文库中识别具有生物学意义的目标和物质，这些技术加速了先进ACT策略的发展。本综述深入探讨了高通量筛选的最新进展，重点介绍了其在T细胞和肿瘤细胞的遗传筛选，以及小分子和靶向递送系统的非遗传筛选方面的应用。这些见解为ACT的未来研究和临床应用提供了有价值的指导。
免疫疗法的快速发展已改变肿瘤学领域，其核心在于免疫系统与恶性细胞之间复杂的相互作用。过继性细胞移植（Adoptive Cell Transfer, ACT）是该领域的基石，其策略是从患者或供体中采集免疫细胞，在体外扩增或基因重编程，随后回输以增强抗肿瘤免疫力。其中，以T细胞为中心的模式，包括肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs）、T细胞受体工程T细胞（TCR-engineered T cells）和嵌合抗原受体T细胞（CAR-T cells），在血液恶性肿瘤中已显示出显著的临床成功。然而，过继性T细胞疗法对某些血液恶性肿瘤和大多数实体瘤并非总是有效，常导致原发性耐药。这种治疗失败由多种机制驱动，如T细胞扩增受损、细胞毒性效力减弱、耗竭的发生以及肿瘤通过抗原丢失或内在抑制途径驱动的免疫逃逸。因此，破译调控T细胞-肿瘤相互作用的信号对于优化细胞疗法至关重要。
遗传筛选涉及设计和整合大型基因编辑文库到细胞池中，允许识别具有生物学重要性的目标，随后通过功能测定进行验证。该方法克服了单基因编辑的局限性，极大地推进了癌症基因组学的见解。CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9）系统因其灵活性和编辑效率，已成为最主要的的高通量基因筛选技术。随着不断进步，使用非双链断裂技术（如碱基编辑器base editors和表观遗传编辑器epigenetic editors）的CRISPR筛选正在兴起，以克服某些技术挑战，并广泛应用于过继性T细胞疗法及相关策略。遗传和非遗传筛选平台的协同作用为理解协同药物组合和精确递送系统提供了更全面的视角。本综述审视了最先进的高通量筛选方法，并评估了其在表征T细胞动态、免疫介导应激下的肿瘤反应以及新兴组合策略方面的当代效用，为未来的临床转化提供了路线图。
论文主体内容总结
2 先进的高通量筛选技术
2.1 遗传筛选
2.1.1 机制与特点
遗传筛选因其高通量和操作效率，为发现新的生物学靶点和调控网络提供了强大框架。该方法包括通过siRNA和shRNA进行的RNA干扰（RNAi, RNA interference），以及变革性的CRISPR/Cas9筛选平台。通过部署靶向全基因组或特定功能子集的综合文库，研究人员可以在目标群体（如T细胞和恶性细胞）中诱导遗传扰动。这些筛选通常在多样化条件下进行，包括体外T细胞/肿瘤共培养、慢性药物挑战，以及在免疫活性或免疫缺陷NSG小鼠模型体内验证。这些设置通常包含空白或条件对照，有时利用生存压力进行比较分析。如果基因编辑导致细胞表型变化，可使用流式细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）根据不同的表面标志物或细胞因子产生对细胞进行分类。随后，高通量测序技术量化每个样本中的单向导RNA（sgRNA, single guide RNA）或其他基因编辑元素。这涉及聚合酶链式反应（PCR, Polymerase Chain Reaction）扩增后读取条形码，并分析sgRNA在基因编辑细胞中的耗竭或富集。
遗传筛选策略通常分为两类：功能缺失（Loss-of-function, LOF）和功能获得（Gain-of-function, GOF）方法。传统平台（包括siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9）主要促进基因沉默或敲除，以发现肿瘤细胞中的耐药基因或免疫区室内的负调控因子。虽然LOF筛选已显著推进了细胞疗法，但整合大型基因盒进行功能修饰代表了更具变革性的前沿。目前，GOF筛选主要利用CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa）来瞬时上调转录；然而，CRISPRa的临床效用常因Cas9-激活子融合体的大尺寸和潜在免疫原性而受限。这凸显了对稳健的CRISPR敲入（CRISPR knock-in, KI）系统的必要性。Roth等人率先使用条形码化的非病毒DNA模板库并行靶向特定基因座，简化了增强T细胞适应性基因的鉴定，并实现了精确的、汇集的GOF评估。此外，条形码化慢病毒开放阅读框（open reading frame, ORF）文库的部署使得在人类原代T细胞中进行基因组规模的GOF筛选成为可能。当与直接ORF捕获和单细胞测序相结合时，这些进展为完善下一代癌症免疫疗法提供了必要的高维度见解。
下游分析是目标识别后的关键阶段，常采用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）来揭示参与T细胞介导的肿瘤细胞毒性的功能通路，并验证与这些功能相关的必需表型。例如，利用CRISPR/Cas9进行细胞修饰或小分子药物调整靶点，有助于确认它们对阳性结果（如T细胞活化、分化和肿瘤细胞毒性）以及阴性条件（如耗竭）的影响。这种方法在T细胞研究中取得了重大进展，有助于更深入地理解细胞反应和相互作用。
2.1.2 新兴的CRISPR筛选工具
siRNA由人工合成的短RNA片段组成，通常限于独立表型筛选形式，如96孔或384孔培养板。另一种策略涉及使用商业siRNA文库，其中每个siRNA分配了独特的条形码。识别有效siRNA的过程依赖于量化这些条形码，这可能范围有限且操作繁琐。shRNA通过病毒载体促进文库筛选，利用深度测序实现更精简高效的过程。然而，RNAi的高通量使用并不总能实现稳定表型所需的基因表达完全抑制，并且通常具有较高的脱靶效应，这会削弱其在实际应用中的准确性。
传统的CRISPR/Cas9基因组编辑诱导靶向DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs），这可能导致许多插入缺失和基因组不稳定。相比之下，失活Cas9（deactivated Cas9, dCas9）和切口酶Cas9（nickase Cas9, nCas9）可有效防止DSBs，从而降低基因突变风险。DNA碱基编辑器（DNA Base Editors, BEs）的发展将焦点从基因删除转移到精确的核苷酸替换。利用sgRNA引导的脱氨酶，BEs能够实现靶向转换，帮助研究人员剖析特定密码子在免疫相关基因中的功能影响。作为补充，CRISPR干扰（CRISPR interference, CRISPRi）和CRISPRa系统提供了一种非整合性的基因表达调控手段。通过将转录调节子定位到转录起始位点（Transcription start site, TSS），这些系统可以沉默或增强内源性转录本，而无需永久改变DNA序列。这种可逆性降低了意外细胞应激的风险，并允许研究在静息状态下可能不活跃的基因。通过使用抑制和激活两种筛选，研究人员可以更准确地绘制调控T细胞和肿瘤细胞相互作用的复杂调控网络。
2.1.3 基于RNA干扰的基因沉默
siRNA和shRNA都通过内源性RNA干扰（RNAi）通路发挥作用，这是一个保守的转录后调控系统，通过序列特异性降解信使RNA（mRNA）来控制基因表达。在哺乳动物细胞中，RNAi介导的沉默由RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）执行，其催化核心包含Argonaut蛋白家族成员，特别是AGO2。合成的siRNA通常以短双链RNA分子的形式直接引入细胞质。一旦进入细胞，双链体被整合到RISC中，乘客链被移除，而向导链仍与AGO2结合。在碱基配对互补性的引导下，AGO2–siRNA复合体与靶mRNA结合并诱导内切核酸酶切割，导致转录本的快速降解和蛋白质翻译的抑制。由于合成的siRNA分子未被基因组整合，并且在细胞分裂过程中逐渐降解或稀释，因此产生的基因沉默是短暂的，通常持续数天。这种短期扰动使得siRNA特别适用于在多孔板格式中进行的阵列化功能筛选。
相比之下，基于shRNA的RNAi提供了更稳定的基因敲低模式。shRNA构建体通常通过整合病毒载体（如慢病毒）递送，实现由RNA聚合酶III启动子驱动的短发夹转录本的持续细胞内表达。在细胞核转录后，shRNA分子依次经过内源性微小RNA机制的加工。发夹前体最初被Drosha–DGCR8微处理器复合体识别，通过Exportin-5输出到细胞质，随后被RNase III酶Dicer切割，生成类似siRNA的双链体。加工后的向导链被加载到RISC中，以类似于siRNA的方式介导序列特异性的mRNA降解。由于shRNA表达盒被稳定整合到宿主基因组中，由此产生的敲低可以持续较长时间，这使其特别适用于长期选择压力下的汇集功能缺失筛选。尽管如此，基于RNAi的方法通常产生部分基因抑制而非完全消融，并且可能因不完美的向导-靶点互补性而产生脱靶效应。
2.1.4 CRISPR-Cas9基因组编辑
与基于RNAi的技术不同，CRISPR/Cas9系统在DNA水平上扰动基因功能，从而实现更持久且通常是永久性的基因修饰。经典的CRISPR/Cas9编辑平台由两个基本组件组成：指导序列特异性DNA识别的单向导RNA（sgRNA），以及在靶向基因组位点附近的原间隔序列邻近基序（protospacer-adjacent motif, PAM）处引入位点特异性双链断裂的Cas9核酸内切酶。
切割后，DSB由细胞的内源性DNA修复机制修复，主要通过两种途径之一。第一种，非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ），是一种易出错的修复过程，经常在断裂位点引入小的插入或缺失，从而破坏编码序列并产生功能性基因敲除。或者，在存在外源供体模板的情况下，细胞可以通过同源定向修复（homology-directed repair, HDR）来修复断裂，允许精确插入或替换定义的DNA序列。由于这些改变直接整合到基因组中，CRISPR介导的修饰通常是永久性的，并在细胞分裂过程中可遗传，为基因组规模的汇集筛选提供了一个强大的平台。
最近的创新进一步扩展了基于CRISPR的扰动系统的多功能性。催化失活的dCas9可以与转录调节因子融合，以在不引入DNA断裂的情况下调节基因表达。在此配置中，CRISPRi将转录抑制因子募集到启动子区域以抑制转录，而CRISPRa募集转录激活因子以增强内源性基因表达。此外，下一代工具如碱基编辑器和先导编辑器能够在没有双链断裂形成的情况下实现精确的核苷酸替换，为剖析免疫调控基因中特定编码变体的功能后果提供了新的机会。
2.1.5 对功能遗传筛选的意义
RNAi和CRISPR扰动平台之间的机制差异直接影响它们在功能遗传筛选中的效用。RNAi技术提供快速可逆的基因表达调节，适用于探究其完全缺失可能致死的基因。相比之下，基于CRISPR的系统可实现稳定的基因破坏或靶向基因组工程，这有利于长期选择实验，并识别控制细胞适应性、免疫信号传导或肿瘤耐药通路的基因。
在癌症免疫学和T细胞工程中，这些互补技术能够系统性地绘制调控T细胞活化、分化、耗竭和肿瘤细胞毒性的调控网络。结合高通量测序读数，汇集的筛选文库使研究人员能够量化特定遗传扰动在不同实验条件下的富集或耗竭，从而揭示塑造免疫-肿瘤相互作用的候选调节因子。
2.2 非遗传筛选
在过继性T细胞疗法中，遗传和非遗传筛选的结合支撑了联合疗法和亲和力研究。全面的药物敏感性筛选揭示了药物治疗与肿瘤免疫疗法协同作用的基因组机制。在此过程中，用荧光素酶标记的肿瘤细胞与T细胞和药物库在96孔或384孔板等格式中共培养。通过评估荧光素酶活性，研究人员可以识别通过改善肿瘤细胞杀伤来增强过继性T细胞疗法疗效的有效药物。随后，利用CRISPR筛选来确定具体机制，帮助揭示各种癌症疗法的免疫调节特性。
非病毒递送载体的非遗传筛选通常利用扩展的化学文库来优化递送性能。初步评估侧重于脂质纳米颗粒的结构特性，其中色谱法和透射电子显微镜等技术用于测量关键参数，包括pKa和表面电荷。后续阶段转向体内模型，以验证在特定组织内的靶向准确性和蛋白质翻译效率。这种系统化优化过程能够识别出优越的递送结构，为改进现代递送系统的组织特异性和整体效力提供了坚实的实验基础。
3 应用于T细胞的遗传筛选
高通量筛选传统上被视为一种随机的靶点发现工具，但对近期数据的荟萃分析揭示了一种趋同的统一工程范式。我们不将已识别的基因视为孤立的“命中”，而是提出过继性T细胞疗法的成功由三个层级调控轴控制：内在适应性、肿瘤-免疫相互作用组和代谢适应。这个框架允许从描述性编目过渡到“合成免疫”的合理设计，其中筛选数据为跨多个生物层次的T细胞行为的系统重编程提供信息。
3.1 具有细胞毒功能的原代T细胞筛选
总体而言，上述筛选策略提供了互补工具，用于系统地探究T细胞功能的关键分子决定因素。基于这些技术平台，最近的研究已直接在原代T细胞中应用基因组规模的扰动筛选，以识别调控关键抗肿瘤表型的基因，包括细胞毒活性、增殖能力和肿瘤浸润。
通过全基因组CRISPR筛选识别出BATF、PRDM1和c-Jun等调节因子，不仅仅是一系列效力增强剂；它定义了一个持久性的核心表观遗传回路。最近的HTS数据表明，这些因子并非孤立作用，而是汇聚起来重塑染色质景观，有效地将T细胞“锁定”在自我更新的、干细胞样记忆状态。例如，发现PRDM1缺失或BATF过表达可以阻止终末分化，这表明下一代ACT将朝着表观遗传变阻器工程发展，即利用筛选命中来调节T细胞库在慢性抗原刺激下的寿命。
表型分选通过FACS实现，或对经历各种筛选条件的细胞群直接进行测序，以识别调控特定功能表型的基因。单基因编辑等技术已被用于改善肿瘤浸润淋巴细胞疗法和CAR-T疗法，证明了通过过继性T细胞疗法治疗肿瘤的成功率提高，并在体外和体内环境中得到验证。
过继性T细胞疗法常因肿瘤浸润不良和静脉输注后的器官滞留而疗效受限。创新的体内筛选已识别出对引导T细胞向肿瘤组织迁移至关重要的基因，如St3gal1和βII-血影蛋白。LFA-1/ICAM-1轴对于有效的细胞粘附同样至关重要。筛选工作表明，敲除RASA3可以优化此迁移过程。通过CFSE染料稀释测量的增殖能力也被用于寻找改善CAR-T细胞持久性的基因；值得注意的是，RASA2敲除增强了白血病模型中T细胞的效应特征。最后，利用CD69作为活化标志物，研究已发现FAM49B作为一个负调控因子，通过破坏Rac依赖性肌动蛋白重组来损害T细胞反应。
对T细胞特异性细胞毒功能至关重要的功能活化位点，可以通过靶向干扰素-γ等细胞因子或分析CD8+CD107a+T细胞来识别。例如，Ye等人通过CRISPRa筛选在CD8+CD107a+T细胞中识别了功能获得靶点，如脯氨酸脱氢酶2。将PRODH2整合到原代或CAR-T细胞中可以改变代谢途径，从而改善各种肿瘤类型的治疗效果。先进的碱基编辑筛选也揭示了等位基因，包括磷酸肌醇3-激酶催化亚基δ的等位基因，可以正面或负面影响T细胞毒性。在T细胞凋亡背景下，Fas-FasL信号传导起关键作用。与正常对照相比，FasL的持续刺激表明早期B细胞因子4调节抗凋亡蛋白c-FLIP的降解，这可能导致细胞毒性T细胞的损失。
T细胞亚群的协调是有效抗肿瘤反应的基石。使用shRNA的机制研究表明，CD8+T细胞的稳定性需要通过染色质重塑主动抑制CD4。为了优化细胞疗法，研究人员经常监测淋巴细胞归巢受体CCR7和CD62L的表达，其高表达是幼稚和中央记忆T细胞的特征，并常用于识别具有增强增殖潜力和长期持久性的T细胞亚群。功能基因组筛选强调了BATF3作为一个关键转录因子，可增加记忆T细胞的数量，从而增强工程化CAR-T细胞的抗肿瘤活性。短寿命效应细胞和记忆前体细胞是可区分的，前者在数天至数周内死亡，而后者演变为记忆细胞并提供长期的保护性肿瘤免疫应答。识别将T细胞推向MP/记忆命运的遗传驱动因素是现代免疫治疗研究的一个主要目标。
3.2 TCR-T和CAR-T细胞直接筛选
在TCR-T和CAR-T细胞群内进行直接的基因组筛选，为优化过继细胞疗法提供了一种强大的方法。通过将sgRNA文库引入工程化T细胞并采用肿瘤共培养测定，研究人员可以通过基于PD-1或细胞因子的分选来分离导致耗竭和细胞毒性的遗传驱动因素。关键发现包括通过PLC和NFATC2调节T细胞活化的SNX9，以及其缺失可防止CAR-T细胞凋亡的TLE4。此外，IKZF2已被识别为NFAT驱动的抗肿瘤反应的调节因子。对介体复合物亚基MED12和CCNC的研究进一步证明了如何利用表观遗传转变来增强CAR-T细胞的效力。这些高通量方法简化了增强肿瘤特异性杀伤靶点的识别，并为评估长期抗原挑战提供了稳健模型，从而推进了免疫疗法的精准性。
此外，随机整合到宿主基因组中可能会破坏靶基因，导致筛选准确性降低并使数据解释复杂化。为了克服这些障碍，研究人员开发了创新解决方案。例如，Dai及其同事设计了一个基于AAV-KIKO的CLASH系统，该系统利用CRISPR/Cas12a技术。使用CLASH平台，研究人员在长期共培养后分析了CD22 CAR-T细胞，发现PR/SET结构域1的外显子3跳跃突变体显著增强了多种抗肿瘤效果。此外，Blaeschke及其团队引入了模块化汇集敲入筛选方法，该方法将功能性模块文库与NY-ESO-1 TCR、CD19-BBz CAR或HA-GD2-28z序列连接到sgRNA上。该技术允许在TRAC基因座生成TCR-T和CAR-T细胞，并支持在细胞池内进行广泛的CRISPR敲入筛选。经过慢性的、重复的共培养和刺激后，他们发现BATF和转录因子AP4的过表达协同影响TCR/CAR基因表达和T细胞功能，这一发现在抗肿瘤免疫的背景下得到了支持。
3.3 CAR结构筛选
优化工程化T细胞与肿瘤抗原景观之间的相互作用对于成功的过继疗法至关重要。考虑到靶向肿瘤相关抗原时存在的脱肿瘤（off-tumor, OTOT）效应风险，研究人员越来越关注CAR的模块化设计以实现最佳亲和力。通过利用“轻链洗牌”来多样化靶向scFv，可以识别区分高密度肿瘤抗原和低密度健康组织表达的受体。例如，将CD38-CAR亲和力降低三个数量级已被证明可以提高治疗多发性骨髓瘤的特异性。通过组合细胞库整合阴性和阳性筛选，进一步简化了高性能CAR设计的识别。此外，在监测CAR表达、抗原识别和信号转导的同时，修改HER2+CAR-T可变重链的互补决定区，证明了CAR结构设计在影响亲和力和细胞毒性方面的重要性，从而减少脱肿瘤效应。
细胞内结构域在调节CAR-T细胞行为中起着至关重要的作用，通常包括来自CD3ζ的免疫受体酪氨酸基激活基序、共刺激结构域以及其他激活或抑制信号。这些信号结构域的组合可以显著影响T细胞的治疗效果。然而，单独设计和测试每个CAR-T构建体的过程可能相当费力。标准化、高通量文库的发展彻底改变了功能性CAR基序的识别。这些正交设计的文库允许在单个细胞池中同时测试多个刺激和抑制信号。通过对持久性和肿瘤杀伤效率的评估，结合下游测序，可以分离出最佳的治疗候选物。显著的进展包括用于CD19靶向治疗的CARPOOL技术和用于HER2+恶性肿瘤的speedingCARs平台，后者通过单细胞测序技术提供了深入的机制见解。这些整合的筛选方法代表了细胞工程领域的范式转变，为优化包括TCR-T或巨噬细胞和NK细胞在内的各种过继细胞疗法提供了稳健的模板。
4 在T细胞压力下对肿瘤细胞进行的遗传筛选
整合跨不同肿瘤组织学的CRISPR敲除筛选揭示了一个共有的耐药“相互作用组”。我们的分析将IFN-γ信号传导和抗原呈递机制识别为免疫逃逸的普遍枢纽。这些命中在不同筛选平台中的高频率表明单一疗法CAR-T方法存在根本性的“盲点”。因此，这些发现需要ACT设计发生转变——从单一靶点优化转向专门设计用于规避HTS识别的适应性耐药回路的“逻辑门控”或多抗原靶向策略。
4.1 抗原呈递的靶向方法
为了解决免疫疗法中原发性和获得性耐药的挑战，高通量功能基因组学为靶点发现提供了一个全面的平台。通过模拟T细胞靶向环境，研究人员可以识别在免疫挑战下导致耐药的肿瘤内在因素。这个过程涉及将基因编辑文库引入肿瘤细胞，随后与效应T细胞共培养以识别“逃逸”基因型。在不同小鼠品系中使用原位或系统性体内筛选进一步阐明了肿瘤微环境的调控景观。最终，此类筛选策略在机制发现与治疗开发之间提供了转化桥梁，能够识别和验证可操作的靶点，并促进增强T细胞免疫疗法的小分子抑制剂和生物制剂的开发。
在过继细胞疗法中，尤其是在涉及工程化TCR-T和CAR-T的疗法中，肿瘤细胞表面抗原与T细胞上工程化的TCR或抗体之间的精确相互作用至关重要。改善抗原呈递和防止抗原下调的策略对于克服耐药性很重要。在用抗MHC抗体刺激或通过共培养后，基于MHC分子和其他肿瘤相关抗原的表达水平进行直接筛选。FACS分选后的后续测序有助于识别与抗原表达正负
