《Journal of Microbiological Methods》：A qPCR method for detection of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’: Optimization of selected assay parameters
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乔纳森·菲利普斯（Jonathan Phillips）|索赫拉布·博达吉（Sohrab Bodaghi）|何塞·A·桑切斯·戈麦斯（José á. Sánchez Gómez）|乔治奥斯·维达拉基斯（Georgios Vidalakis）|格雷戈尔·布拉哈（Gregor Blah
乔纳森·菲利普斯（Jonathan Phillips）|索赫拉布·博达吉（Sohrab Bodaghi）|何塞·A·桑切斯·戈麦斯（José á. Sánchez Gómez）|乔治奥斯·维达拉基斯（Georgios Vidalakis）|格雷戈尔·布拉哈（Gregor Blaha）
美国加利福尼亚大学河滨分校生物化学系，邮编92521
摘要
‘Candidatus Liberibacter asiaticus’（CLas）被认为是黄龙病（HLB，柑橘绿化病）的致病菌，对全球柑橘生产构成了严重威胁。由于目前尚无有效的治疗方法，受感染的树木会迅速衰退，整个果园可能会遭到毁坏。减缓黄龙病的传播依赖于对CLas的早期准确检测以及及时移除受感染的树木。在加利福尼亚州，定量聚合酶链反应（qPCR）仍是检测该病原体的金标准方法。要达到理论检测限（即在样本中检测到单个CLas细胞），需要调整整个实验流程，而不仅仅是引物和探针。本文测试了四个实际可行的改进措施：PCR反应板的颜色（透明、黑色和白色）；移液操作的稳定性；常用的PCR增强剂；以及添加逆转录步骤以实现对总核酸提取物的RT-qPCR检测。使用白色反应板可以增强荧光信号并提高重复实验结果的Ct值稳定性。改进移液操作减少了操作者带来的实验误差。在测试的增强剂中，1–2%的甘油能够在低CLas浓度下提高检测灵敏度。添加逆转录步骤可使Ct值降低至少5个循环，从而将检测灵敏度提高约32倍。这些低成本改进措施共同推动了常规qPCR技术向单菌检测水平的发展，同时减少了CLas监测过程中的不确定性。
