《Cancer Reports》：Evaluating Sequencing Strategies for Endometrial Microbiome Profiling in Endometrial Cancer: A Comparative Study of Short- and Long-Read 16S rRNA Approaches
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子宫内膜癌（EC）是全球最常见的妇科恶性肿瘤，发病率持续上升且预后差异显著。在新西兰，EC发病率近十年增长近60%，毛利族和太平洋岛裔女性受影响尤为严重，面临更高的晚期疾病风险和更差的预后。微生物失调（dysbiosis）已被认为参与EC的发生发展，但子宫内膜
子宫内膜癌（EC）是全球最常见的妇科恶性肿瘤，发病率持续上升且预后差异显著。在新西兰，EC发病率近十年增长近60%，毛利族和太平洋岛裔女性受影响尤为严重，面临更高的晚期疾病风险和更差的预后。微生物失调（dysbiosis）已被认为参与EC的发生发展，但子宫内膜微生物组研究面临微生物生物量低和污染风险高的双重挑战。本研究旨在探索可指导更大规模队列试验准备的方案，研究人员比较了短读长Illumina MiSeq和长读长Oxford Nanopore Technologies（ONT）16S rRNA基因测序平台对EC患者子宫内膜微生物组的谱型分析效果。
研究人员采集了子宫内膜和阴道拭子样本，从DNA回收率、测序成功率、多样性指标和分类学分辨率等方面评估了两个平台的性能，同时评估了样本冷冻或立即裂解对DNA提取的影响。结果显示，ONT测序提供了增强的种级分辨率和低丰度分类群的检测能力，但在低产量样本中表现不稳定。冷冻处理后再进行细胞DNA提取可适度增加细菌16S拷贝数并改善群落一致性。两个平台均存在污染问题，尤其是在低生物量样本中，但可通过数据分析阶段进行控制。
该研究为子宫内膜微生物组研究中的测序平台选择和样本处理提供了实践指导，支持未来阐明微生物对EC发病机制贡献的工作，并强调了严格污染控制的重要性。该研究首次呈现了新西兰队列数据，为以往代表性不足的人群贡献了宝贵资料。
**研究背景与意义**
子宫内膜癌（EC）是全球最常见的妇科恶性肿瘤，在高收入国家尤为突出，约占子宫癌的95%，通常发生于绝经后女性。尽管早期EC往往可治愈，但晚期或复发性疾病仍构成重大临床挑战。在新西兰，EC发病率近十年增长近60%，毛利族和太平洋岛裔女性受到不成比例的影响，表现为更高的侵袭性疾病发生率、诊断延迟和更差的预后，这凸显了对EC发病机制深入理解的迫切需求。
高通量测序技术的进步彻底改变了研究人员对微生物组及其在免疫、代谢和疾病中作用的认识。在肿瘤学领域，微生物失调已与结直肠癌、宫颈癌和乳腺癌相关联，而其在EC发病中的潜在作用日益受到关注。子宫曾被认为是私密环境，现已知宿主独特的动态微生物群落，尽管其丰度低于相邻生殖道区域。新出现的证据表明，微生物失衡可能影响局部炎症、免疫调节和致癌过程。然而，子宫微生物组研究仍十分有限，主要受技术挑战制约，其中低生物量样本的准确分类和污染易感性是关键难题。
16S rRNA基因测序因其经济性而被广泛用于细菌群落谱型分析，但平台选择直接影响分辨率和可靠性。短读长Illumina MiSeq测序具有高准确度和成熟的生物信息学支持，但其短读长限制了属级和种级分类能力。相反，长读长ONT测序可实现全长16S谱型分析，有望提高分类学分辨率和低丰度分类群的检测能力，且其从低起始量样本生成序列数据的潜力使其适用于生物材料有限的研究。尽管技术不断进步，但针对低生物量子宫样本的系统平台比较研究仍然缺乏，更无研究聚焦于新西兰这一地理隔离、具有独特人口学和临床特征的人群中的EC患者。此外，样本保藏和DNA提取方案等方法学变量也可能影响微生物群落谱型，但这些因素在低生物量环境中很少被评估。
**研究方法与技术路线**
本研究采用成对比较设计，纳入新西兰惠灵顿Te Whatu Ora医院接受子宫切除术的EC患者。研究人员在严格伦理审批下（新西兰健康与残疾伦理委员会HDEC 15/CEN143及奥塔哥大学H20/002、H25/0421），从26例患者中采集了112份样本，包括肿瘤部位和相邻非肿瘤组织的成对拭子。另外，研究纳入了3例因疑似子宫内膜异位症接受手术者的阴道拭子作为高生物量阳性对照。
关键技术方法包括：（1）多样本处理与保藏策略比较：采用四种拭子和存储方案（A-D），涉及不同拭子类型、缓冲液组成和存储温度，包括室温裂解缓冲液保存、专用采集拭卡、TE缓冲液离心后裂解，以及-80°C冷冻后解冻处理；（2）微滴式数字PCR（ddPCR）：采用Bio-Rad QX200系统，同时检测人NRAS基因和细菌16S rRNA基因，定量人源与细菌DNA比例，评估样本质量；（3）Illumina MiSeq短读长测序：针对16S rRNA基因V3-V5可变区，采用ZymoBIOMICS微生物群落DNA标准品作为阳性对照，经两轮PCR扩增、磁珠纯化和Nextera XT索引后，在Illumina MiSeq平台使用600-cycle v3试剂盒（2×300 bp）测序；（4）ONT长读长测序：采用覆盖全长16S rRNA基因（27F-1492R）的通用引物，经两轮PCR扩增、EXP-PBC096条形码标记和SQK-LSK114连接测序试剂盒建库后，在PromethION FLO-PRO114M流通池上测序，碱基识别采用Dorado v0.8.0软件，先实时高精度模式后超高精度模式；（5）生物信息学分析：Illumina数据采用QIIME2（2024.2 amplicon distribution）流程，DADA2去噪，基于SILVA 138和NCBI数据库的朴素贝叶斯分类器进行分类；ONT数据采用Epi2me 16S流程，minimap2映射至SILVA 138.1数据库。多样性分析在R环境下进行，采用vegan、phyloseq等包计算α多样性（Observed丰富度、Shannon指数、Simpson指数）和β多样性（Bray-Curtis相异度、主坐标分析PCoA、PERMANOVA检验）。
**研究结果**
**3.1 DNA产量与测序成功率**
研究初始队列包含3例毛利族、2例太平洋岛裔，其余为欧洲裔。3例非浆液性/子宫内膜样亚型患者被排除。ddPCR显示子宫拭子平均人源-细菌DNA比为166:1，远低于阴道拭子的1:5.5，证实子宫样本低生物量特征，但所有样本均可检测到细菌DNA。46份拭子经双平台测序，ONT平均读数677,000，Illumina仅110,000；Illumina成功率75%低于ONT的87%。经质控后38份样本纳入比较分析。
**3.2 分类学分辨率与读深**
以经过基准测试的SILVA数据库进行属级比较分析。ONT测序在门至属级均保持约80%的读数分配率，反映全长16S覆盖多个可变区的优势。Illumina在较高级别分类水平表现优异（门至目级95%），但至属级降至70%，体现短读长的固有限制。NCBI数据库虽支持种级分辨率，但SILVA在高级别分类上更为可靠。
**3.3 α与β多样性：属丰富度、均匀度和群落组成**
α稀疏分析采用平台特异性阈值：ONT 140,000读数，Illumina 10,000读数。ONT显著更高的属丰富度（平均53.3 vs 18.4属，p=0.000000521）提示长读长结合高深测序度可检测更广泛分类群；但均一化至10,000读数后差异消失。Shannon指数在Illumina略高（1.74 vs 1.37, p=0.000467），Simpson指数同样如此（0.673 vs 0.619, p=0.00850），表明Illumina读数在分类群间分布更均匀。Bray-Curtis相异度PCoA显示测序平台解释了12.8%的变异（p=0.001），但多数配对样本聚类紧密。
**3.4 群落结构差异与分类学分辨率**
两平台总体一致性良好，患者间变异大于平台效应。典型案例为Comamonadaceae科：ONT鉴定出23个属，Illumina仅4个；Illumina样本中79%该科读数仅分配至科级别，而ONT仅0.003%滞留于科级别，主要分配至Acidovorax（40%）、Pelomonas（36%）和Aquabacterium（20%）。Acidovorax完全未被Illumina检出。这凸显了ONT在低生物量环境中提供更精细群落结构视图的能力。
**3.5 潜在污染物检测**
高生物量阴道样本作为阳性对照，表现低丰富度、低多样性，以Lactobacillus为主，形成与子宫样本明显分离的聚类。负压对照分析显示：Illumina负压对照读数不足无法分析；ONT两个负压对照分别产生506,090和250,240读数，与子宫拭子（14,689-1,249,523）相当。PCA显示无模板对照与部分子宫样本聚类。测序对照检出Enhydrobacter、Cutibacterium和Acinetobacter（皮肤或环境来源），处理对照以Lactobacillus为主（可能存在阴道样本交叉污染）。这些发现指导了低丰度信号的解释，突显了区分真实生物学信号与背景污染的必要性。
**3.6 样本采集与存储方法优化**
四种方法比较显示：Method B（立即裂解，室温保存）DNA产量略高但细菌比例持续偏低；Method D（-80°C冷冻保存，解冻后处理）细菌拷贝数最高，无PCR抑制现象。α多样性分析显示各方法间无统计学显著差异，但Method C和D的属数鉴定变异更大，提示对患者特异性谱型更敏感。β多样性PCoA显示各方法间大量重叠，但Method C与D存在显著差异（R
2=0.218, p=0.035），方法间变异小于患者间变异。个体案例分析显示Method D在多位点一致检出Lactobacillus，其他方法未呈现此模式。综合评估Method D为低生物量子宫拭子分析的最优方案。
**3.7 处理方法的分类学组成**
不同患者同一方法间存在显著差异，但Method D显示略高的细菌读数和更稳定的群落谱型，尤其是在关键属的检出一致性方面，支持其作为未来子宫微生物组研究的标准化处理方案。
**讨论总结**
本研究为新西兰EC患者子宫微生物组研究奠定了基础，填补了全球微生物组研究中的重要空白。新西兰队列数据的首次呈现具有重要价值，因为大洋洲在微生物组研究中代表性严重不足，而地理、生活方式和种族因素影响微生物组组成，国际队列数据不能直接外推。
**测序平台性能比较**：ONT与Illumina的微生物谱型差异主要由靶向16S rRNA区域不同所致。既往研究表明不同可变区优先检测特定分类群。本研究中，ONT全长16S rRNA（V1-V9）测序揭示更丰富多样性，实现更低分类水平的精确分配；Illumina仅靶向V3区，限制了细微分辨率。这一增强分辨率在肿瘤研究中尤为重要，低丰度或方法敏感性分类群的检测可能揭示与肿瘤亚型、免疫浸润或治疗反应相关的罕见微生物特征。此外，两平台生物信息学流程差异显著：Illumina采用99%相似度的朴素贝叶斯分类器，ONT则使用minimap2以95%相似度和90%覆盖度阈值，适应其较高错误率。尽管有这些调整，ONT在高级别分类上较低的分配率仍反映残余错误和有限校正能力，但技术持续改进正不断提升其准确性。
**种级局限与分类学模糊性**：基于16S rRNA的种级鉴定仍具挑战，尤其使用SILVA数据库时。16S基因本身无法可靠区分近缘种（如Shigella和Escherichia中的种）。本研究中，Streptococcus、Staphylococcus和Cutibacterium等先前报道于子宫微生物组研究的属，包含常见于皮肤、土壤或水中的种，缺乏种级分辨率难以确定其真实来源。Porphyromonas somerae被认为参与EC发病机制，但本研究虽检出Porphyromonas，无法确认P. somerae的存在，限制了探索其与肿瘤生物学关联的能力。未来研究可考虑全基因组鸟枪法测序或宏转录组学，但成本更高、分析更复杂。
**子宫微生物组组成**：本研究部分样本以Lactobacillus为主，与近期报道的EC患者L. crispatus耗竭及其抗增殖效应一致；但其他样本富集Acinetobacter、Pseudomonas和Comamonadaceae，与Winters等的EC患者发现相符。这些属常与生态环境相关，可能反映真实定植或污染，需扩大全球子宫数据集解答。检测到既往与EC相关的Bacteroides、Prevotella和Shigella，其中Porphyromonas和Prevotella作为EC相关微生物组的反复出现分类群备受关注。子宫微生物组在健康和EC患者中的组成仍是活跃研究领域，受方法学和队列特异性因素驱动，或两者共同作用。
**污染风险与控制策略**：低生物量微生物组研究中的污染是最重大挑战之一。污染源包括采样器械、DNA提取试剂盒、测序试剂和实验室环境。商业DNA提取试剂盒携带"试剂微生物组"，可引入一致但误导性的谱型。本研究纳入DNA提取空白和无模板测序对照，负压对照中检出的皮肤相关（Cutibacterium、Enhydrobacter）、水相关（Acinetobacter）和阴道菌群（Lactobacillus）分类群指导了微生物谱型的解释标准。未来研究需更广泛、分阶段的特异性对照，结合统计去污染工具，以提高微生物信号的置信度。
**样本处理方法与可重复性**：方法学差异导致微生物谱型的细微变化。冷冻可破坏细菌细胞壁（尤其革兰氏阳性菌），增强DNA提取效率，但在本数据中未观察到粪便微生物组研究中常见的Firmicutes/Bacteroidetes比值变化。四种收集方法的差异虽不意外，但凸显了DNA采集和存储方案一致性对跨实验或研究比较的重要性。对于EC而言，微生物组谱型的可重复性对识别可指导诊断、预后或治疗反应的生物标志物至关重要，低生物量样本处理方案的标准化将是推进EC微生物组研究和实现跨队列荟萃分析的关键。
**研究结论**
本研究为新西兰EC患者子宫微生物组研究提供了基础性见解，为解决全球微生物组研究中的重大空白做出了贡献。研究建立了经过优化的可重复子宫样本采集和处理方案，改善了细菌DNA回收和测序深度。比较分析确定ONT为低生物量环境的首选平台，提供更优的属级分辨率和更广的分类学覆盖。研究证明了在整个工作流程中（从样本采集到测序）实施污染控制的必要性，这在肿瘤研究中尤为关键，因为微生物信号可能细微但具有生物学意义。最终，更清晰的子宫微生物组理解可能为EC的诊断或治疗策略提供信息，微生物特征可作为早期检测的生物标志物、按肿瘤亚型或风险分层患者，或指导微生物组靶向干预。未来研究应探索纵向采样、整合宿主转录组或免疫学数据，并评估微生物功能，以更好理解EC中的宿主-微生物相互作用。
