《Advanced Biotechnology》：Duckweeds: from fundamental biology to a sustainable plant chassis for biotechnology
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这篇综述系统阐述了浮萍（Lemnaceae）从一种基础生物学研究模型向下一代可持续生物技术平台转型的进程。文章深入剖析了浮萍独特的生物学特性，如极端简化（reductive evolution）的体式、极高的表型可塑性、简化的表观基因组（epigenome）及由此带来的高外源基因表达优势。通过解码其简约基因组，结合高效的遗传转化和CRISPR-Cas9等基因编辑工具，研究者已能对浮萍进行精确的遗传和代谢工程改造。相较于烟草等传统系统，浮萍在无土、密闭培养下的快速生长及其可食性，为分子农业提供了独特优势。文章重点展示了其在生产疫苗、治疗性蛋白和高价值代谢物方面的工程进展，并指出未来需聚焦于整合组学数据库、通用遗传工具包和可扩展培养技术，以推动浮萍从概念验证迈向工业化应用，成为生物经济中一个多功能且强大的底盘生物。
引言
浮萍（Lemnaceae）是地球上最小、生长最快的开花植物。长久以来，它们在传统农业和水生生态系统中扮演着角色。然而，近年来多学科领域的进展，已将这些不起眼的水生植物推向了可持续生物技术的前沿。本篇综述旨在聚焦于将浮萍从一个模型系统，转变为一个用于工业生物技术的工程化植物底盘（plant chassis）的转化进程。这一定位的实现，基于三个相互关联领域的进展：高质量组学资源的爆发（基因组、表观基因组、单细胞图谱）解码了浮萍简约生物学的遗传基础；遗传工具的快速演化，从基础转化方案到CRISPR-Cas9编辑和高通量递送方法；以及将这些能力与分子农业、代谢工程和废水修复等实际应用的整合。尤为关键的是，浮萍展现出相对于烟草、微藻等已有底盘系统的独特优势，包括密闭水生培养、可食性、低木质素含量和简化的表观基因组，使其特别适合规模化、密闭的生物制造。
浮萍表型：发育优势与环境可塑性
浮萍是被子植物中的一个特例。其形态极度简化，核心是一个被称为叶状体（frond）的叶状结构，可进行无性繁殖，每1-3天即可增殖一代。这种简化结构是简化进化（reductive evolution）的产物，即陆生祖先植物在适应水生生活方式的过程中，逐渐失去了复杂的根部和维管组织等结构。浮萍科包含五个属（Spirodela, Landoltia, Lemna, Wolffiella, Wolffia），形成了一个从结构相对复杂、有根的Spirodela到无根、针尖大小的Wolffia的进化梯度。这种幼态持续（neotenic）的生活方式是其快速无性增殖的关键，也构成了其在生物技术中应用性的生物学基础。
浮萍的生长由叶状体基部一个或两个芽囊（budding pouches）中的分生组织活动驱动。尽管对其细胞和分子机制的认识尚有空白，但囊泡运输调节因子和生长调节转录因子（GRFs）可能在其超高速细胞分裂和扩张中起关键作用。开花在浮萍中罕见，但其诱导对育种至关重要。成花素（florigen）途径的分子组分，包括FLOWERING LOCUS T (FT)和FLOWERING LOCUS D (FD)基因，在浮萍中是保守且具有功能的。利用特定光周期、培养基和水杨酸等补充剂，已对多个属的开花诱导方案进行了优化。
浮萍对环境信号表现出显著的表型可塑性，直接影响其发育和生物质组成。营养可用性是主要的生长调节因子。营养丰富的条件促进叶状体快速增殖，而营养饥饿则触发深刻的发育转换，导致淀粉和脂质的积累，并是形成休眠芽（turion）的关键信号。这些环境信号通常由植物激素介导。脱落酸（ABA）是胁迫响应和休眠的核心调节因子。乙烯、ABA和水杨酸共同协调通气组织（aerenchyma）的形成。外源施加ABA在营养饥饿条件下可协同增强淀粉积累，展示了激素与环境通路的交叉。
浮萍环境发育可塑性的一个典型例子是休眠芽（turion）的形成，这是应对冬季或干旱等不利条件形成的致密、休眠的营养繁殖体。其发育由营养短缺、拥挤和日照缩短等逆境诱导，ABA信号传导在其中起着关键作用。这个过程涉及叶状体分生组织的重编程：细胞分裂停止，细胞壁加厚，并大量积累储存物质。成熟的休眠芽下沉并进入休眠状态，转录组比较揭示了其分子层面的剧烈转变，与胁迫耐受、淀粉/脂质代谢和休眠相关的通路上调。休眠的打破需要特定的环境信号，主要是长时间的低温（层积处理）和随后的升温与光照。休眠芽的萌发涉及快速动员储存的淀粉和脂质，以支持新叶状体的生长，重新激活营养生长周期。
解码简约蓝图：基因组、表观基因组与系统生物学洞见
高通量组学技术的应用彻底改变了浮萍研究，使其从一个生理学奇观转变为一个定义明确的模型系统。基因组、转录组、表观基因组和代谢组学共同揭示了其极端生物学的遗传和分子基础。
基因组学洞见
对Spirodela polyrhiza和Lemna minor等关键物种的高质量、染色体级别基因组组装，为理解浮萍生物学提供了基础资源。跨五个属的基因组比较揭示了一个清晰的简化进化叙事。基因家族动态分析显示，与已丢失或简化结构和功能相关的基因家族（如木质纤维素生物合成、根系发育、气孔功能相关基因）呈现系统性缩减。最近获得的、结构最简化的Wolffia australiana染色体级别基因组组装，为其无根表型提供了分子证据，显示与拟南芥相比，其在生长素信号和维管发育相关基因上存在显著收缩。尽管存在整体缩减，但浮萍也展现出与生态位适应相关的靶向基因家族扩张。例如，Spirodela polyrhiza显示出抗病基因（包括编码抗菌肽和引导蛋白的基因）的显著串联重复。同样，一个扩张的黄酮类生物合成通路被认为与其漂浮生活所需的紫外线（UV）保护和抗氧化防御有关。细胞基因组学研究已对所有36种浮萍的染色体数目和基因组大小进行了编目，揭示了复杂的全基因组复制、杂交和多倍化历史。三倍体杂交种很常见，这得益于强制执行生殖隔离的遗传通路（“三倍体障碍”）的丢失。
表观基因组学与染色质
浮萍对植物表观遗传学的既定范式提出了挑战。与拟南芥等模式植物相比，浮萍克隆、快循环的生活方式与一个根本简化的表观遗传景观相关。Spirodela polyrhiza丢失了经典RNA介导的DNA甲基化（RdDM）通路的关键组分，导致其24-核苷酸小干扰RNA（siRNA）水平极低，基因内和重复元件中的胞嘧啶甲基化水平大幅降低。尽管存在低甲基化，其基因组却保持稳定，转座子（TE）并未失控。研究表明，虽然大多数退化的转座子缺乏DNA甲基化，但它们被替代的异染色质修饰（如H3K9me1和H3K27me1）所标记，表明存在一个DNA甲基化非依赖性的维持系统。而完整的、可能具有活性的转座子，则仍然受到一种残余的、聚焦的RdDM机制靶向。这揭示了一种适应了克隆繁殖的选择性、流线型沉默策略。
转录组学与单细胞分辨率
转录组学研究连接了基因组与表型，阐明了浮萍对环境动态响应的功能组织。RNA-seq分析绘制了关键性状背后的转录网络。对休眠芽的研究，鉴定了调控淀粉/脂质代谢和胁迫耐受的主调节因子，这些因子参与了这种发育转换。光质（红光与蓝光）差异性地调节淀粉与蛋白质积累的通路，为根据最终用途（如生物燃料与饲料）调整生物质组成提供了调控手段。最近的研究已开始将单细胞/细胞核RNA-seq应用于浮萍。在高度简化的Wolffia australiana中，该方法仅解析出四个主要细胞簇（水生/气生薄壁组织和表皮细胞），且定义组织特化的基因数量惊人地少，证实了其“流线型生物体”的状态。对Lemna minuta的初步细胞图谱也定义了推定的细胞类型，并突出显示了高表达元素转运基因的叶肉细胞，这与植物修复能力相关。这些研究代表了绘制整个植物细胞图谱的第一步。
代谢组学与整合组学
将基因组与代谢组关联起来对于工程化代谢产出至关重要。代谢组学和全基因组关联分析（GWAS）正在揭示浮萍化学成分的遗传结构。一项对137个Spirodela polyrhiza基因型进行的里程碑式GWAS，分析了42种代谢物，揭示了一个基本的生长-代谢权衡：生物量与游离氨基酸（如谷氨酰胺）呈正相关，但与黄酮类等特化代谢物呈负相关。这为工程化提供了一个关键挑战：如何在提升高价值化合物的同时不影响生长。同一研究还指出了与多个代谢性状共同关联的候选基因，包括涉及光合作用、蛋白质降解和器官发育的基因。这些是进行多重编辑以同时优化产量和代谢物含量的首要靶点。
构建工具箱：从基础转化到精确基因组编辑
浮萍基因操作技术的发展历程，映射了建立一个新模型系统的更广泛故事：从具有挑战性、耗时的初步成功，到日益简化、高效和多功能的工具。
基础工作与基于愈伤组织的转化时代
浮萍基因转化在20世纪末和21世纪初的成功是一个关键的概念验证，尽管当时的方法复杂且具有物种依赖性。早期的报告主要使用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的转化。一个重要的里程碑是从稳定转化的Spirodela polyrhiza植物中纯化出可溶的重组GFP蛋白，表明浮萍有潜力成为目标产物的生物工厂。早期的方案依赖于特定的植物生长调节剂（如BAP, 2,4-D, TDZ）、共培养条件和选择剂，流程复杂。这些早期方案虽然证明了稳定、可遗传的转基因整合是可能的，但也突显了主要瓶颈：耗时长、效率低以及显著的基因型限制。
方案优化与直接叶状体转化方法的出现
2010年代出现了旨在优化方案、减少对困难组织培养步骤依赖的协同努力。研究聚焦于优化影响农杆菌毒力和植物细胞感受态的因素，如乙酰丁香酮浓度、共培养时间、菌株和材料类型。这一时期稳定转化方面最显著的进步是叶状体转化系统（FTS）的发展。这种范式转换的方法完全绕过了漫长的愈伤组织阶段，农杆菌直接感染完整的叶状体或叶状体碎片，从中再生出转基因植株。与需要8-9个月的传统愈伤组织转化系统（CTS）相比，FTS能在约3个月内产生稳定的转基因株系，并且关键是适用于更广泛的、此前因难以诱导愈伤而无法转化的Lemna minor基因型。
工具包的扩展：瞬时表达与内源启动子
在改进稳定转化的同时，研究者开发了强大的瞬时表达系统。在Spirodela polyrhiza和Landoltia punctata中使用去病毒化载体，能够在数天内实现极高产量的蛋白生产。另一个关键的进步是超越了仅依赖于花椰菜花叶病毒35S启动子。在Landoltia punctata中发现并表征了强力的内源启动子LpSUT2，其解决了在胁迫下转基因沉默的关键限制。与在高抗生素选择压力下会发生甲基化和沉默的35S启动子不同，LpSUT2能维持高活性，确保了异源蛋白的强健稳定表达，这对工业生物生产至关重要。
CRISPR-Cas9革命与新型递送方法
CRISPR-Cas9基因组编辑技术在浮萍中的首次应用报道，标志着从转基因技术向精确基因组工程的过渡。通过优化农杆菌介导的转化方案，实现了5-6周的快速周期和超过14.3%的双等位基因突变体成功率，为功能基因组学和性状工程打开了靶向基因敲除的大门。最近的前沿是开发极度简化的、“免手动”递送方法，旨在用于高通量合成生物学。“浮萍浸染”法代表了这一趋势，它仅涉及将Spirodela polyrhiza浸泡在包裹有质粒DNA的碳纳米管溶液中，植物直接从培养基中吸收DNA以表达转基因，无需农杆菌或复杂的物理渗透。基于此，研究人员还报道了一个针对Spirodela polyrhiza的完全优化、高效率平台，在从愈伤组织诱导到稳定转化再到可视化标记物无选择等每个阶段都实现了超过90-100%的效率，整个过程仅需数周而非数月。同时，研究人员也建立了使用Spirodela polyrhiza SP162的稳定、可重复转化系统，该品系不仅具有公开可用的基因组信息，还提供了用于基因组编辑的在线工具。这些创新旨在消除常规基因操作的最后主要瓶颈。
浮萍在可持续农业与环境修复中的应用
尽管浮萍如今被誉为合成生物学的有前景的底盘，但它在人类社会的实际应用价值有着深厚的历史根基。几个世纪以来，这种快速生长的水生植物在亚洲和其他地区的传统农业和环境管理中已被利用，被用作牲畜和鱼类的营养补充、富营养化水的天然净化器以及可靠的生物质来源。当代研究正在用现代科学方法严格验证这些传统用途，量化其功效，并揭示使其在这些角色中异常有效的复杂生物学机制。
在动物饲料方面，现代动物饲养研究一致证实，浮萍可以成功地纳入家禽日粮，且不影响生产力。用Lemna minor替代常规饲料成分，不仅不影响产蛋量和蛋重，还能增强蛋黄颜色，并显示出肝保护作用的迹象。这证明了浮萍不仅是一种填充物，还是一种功能性的饲料成分。浮萍生物质的营养成分可以通过培养条件进行人为调控。对Lemna minor中氮和磷可用性的系统研究表明，氮磷组合施用可最大化生物量生产，蛋白质、脂质和碳水化合物含量在优化营养条件下可达特定水平，为生产针对特定饲料应用的营养定制生物质提供了框架。
在环境管理方面，浮萍在植物修复方面的熟练性正被精确剖析。其形成致密垫状层的生长方式，为改善水质和减轻农业污染提供了一个多功能、基于自然的解决方案。浮萍在减少氨（NH3）挥发方面的作用是一个引人注目的例子，这是灌溉稻田中主要的氮损失途径和空气污染源。田间研究表明，稻田上完全的浮萍覆盖可以几乎完全抵消由干湿交替等节水灌溉技术引起的氨排放增加。其机制是三重的：物理垫层阻碍气体交换，植物直接从水中吸收铵离子，以及覆盖层降低水温以进一步抑制挥发。此外，对新兴污染物如纳米塑料的相互作用研究也达到了前所未有的分辨率。单细胞转录组学研究揭示，浮萍对纳米塑料表现出细胞类型特异性的胁迫响应，叶肉细胞和表皮细胞激活不同的解毒和代谢途径。有趣的是，在转移到清洁水中后，吸收的纳米塑料有相当一部分可以被排出，展示了一种主动的、动态的响应，而非被动积累。这种对其胁迫响应和恢复潜力的深入机制理解，强调了浮萍的内在韧性，并完善了其作为污染生态系统中敏感生物指示剂和修复剂的特性。
在现代验证传统用途方面，最引人注目的是淀粉生产。通过结合营养限制和二氧化碳补充，研究人员在Landoltia punctata中实现了惊人的淀粉产量，达到干重72%以上，生产率达每天每平方米10.4克。整合多组学分析揭示了这种超量积累背后的协同分子转变：淀粉生物合成途径中的关键酶显著上调，而木质纤维素和蛋白质等竞争产物的途径则下调。这种在无需耕地、简单的水生系统中实现的高效光合碳利用，确立了浮萍作为工业淀粉的一种引人注目且高产的非常规作物，对生物燃料和生物聚合物产业具有清晰的意义。
浮萍作为下一代底盘：工程化可持续生物工厂
新兴的植物分子农业领域旨在将植物转化为高效、可扩展和可持续的生物反应器。虽然烟草等传统系统已在这一领域开创先河，但浮萍正迅速崛起，成为一种具有独特优势的下一代底盘。该领域的基础性工作主要集中在为兽医和医学应用生产抗原和免疫调节剂，证明了转基因产品的稳定表达和功能活性。第一个在浮萍中表达动物疫苗抗原的报道是猪流行性腹泻病毒（PEDV）刺突蛋白在Lemna minor中的表达，证实了在该系统中生产免疫原性蛋白的可行性。随后是禽流感病毒H5N1保守M2e肽在浮萍中的高产量表达。最近，在Lemna minor中开发了高效的转化方案，并用于生产鸡白细胞介素-17B和EpiC疫苗。这种细胞因子，当以转基因浮萍生物质口服给药时，可作为一种有效的黏膜疫苗佐剂，增强鸡的全身和黏膜免疫。这些研究共同验证了浮萍生产具有生物活性、复杂蛋白的能力，且这些蛋白在下游应用中保持功能。
作为生产平台的战略优势
比较突显了一系列融合优势，使浮萍在商业生物制造，特别是涉及直接消费或密闭性至关重要的应用中，占据独特地位。其最引人注目的属性是其指数级生长速度，是维管植物中最快的之一，这转化为潜在更短的生产周期和单位时间内更高的体积产量。其在简单矿物营养液中的生长消除了对耕地或土壤的依赖，可实现受控环境下的垂直农业。在密闭室内系统（如生物反应器或可控环境垂直农场）中培养时，浮萍提供了显著的生物安全性优势。作为一种专性水生植物，其根极度简化，在陆地生态系统中建立和持久生存的能力极为有限。与烟草不同，浮萍天然可食且营养丰富，使得原始生物质适合直接口服递送或作为饲料添加剂，无需广泛的纯化或解毒。浮萍体型计划的进化简化延伸到了其细胞
