《Microchemical Journal》：Development of reference material of resistance gene sul1 by digital PCR and high-performance liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry
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sul1基因参考材料的建立与验证采用数字PCR和HPLC-同位素稀释质谱法确保其准确性和稳定性，为抗生素抗性基因检测提供可追溯标准。
Jin Yang|Xia Wang|Yang Liu|Yunhua Gao|Chunyan Niu|Lianhua Dong|Jingya Yang
中国国家计量研究院先进测量科学中心，北京100013
摘要
磺胺类药物抗性基因在环境中广泛存在，其准确量化是评估抗生素抗性污染程度和抗性基因传播风险的核心指标。为了确保不同实验室监测数据的可比性和可靠性，建立基因参考物质（RM）是实现准确测量的基本前提。在本研究中，我们开发了针对基因的RM，并使用数字PCR（dPCR）和高性能液相色谱-同位素稀释质谱法（HPLC-IDMS）对其进行了量化。所建立的dPCR方法表现出良好的线性（R2=0.9999）和重复性（RSD<19%）。对于HPLC-IDMS，通过酶解后测定脱氧核苷一磷酸（dNMPs）来量化DNA，从而实现可追溯的定量。两种方法的量化结果没有显著差异，证实了其良好的一致性。制备的RM在长期储存（-70°C）和短期运输条件（使用冰袋）下均表现出令人满意的均匀性和稳定性。该RM的认证值为（1.32±0.10）×10^9拷贝/μL（k=2）。这种RM为基因检测的质量控制提供了可追溯的标准，有助于提高抗生素抗性基因量化结果的准确性和可比性。
引言
抗生素是一类从微生物中提取或人工合成的化合物，其作用是抑制或杀死微生物[1]。作为重要的治疗剂，它们被广泛用于人类医学和畜牧业中，用于疾病预防、治疗和促进生长[2]。在应用过程中，抗生素及其代谢物可以通过人类和动物排放到环境中，导致抗生素抗性细菌和抗生素抗性基因（ARGs）的广泛出现、积累和传播[3][4]。这一现象对全球生态系统和公共卫生构成了重大威胁。
磺胺类药物是首批大规模生产的临床用抗生素，具有对氨基苯磺酰胺核心结构，被广泛应用于人类和兽医医学中，用于治疗和预防细菌感染[5][6][7]。然而，它们的广泛使用推动了全球磺胺类药物抗性的出现。主要的抗性机制涉及二氢叶酸合成酶基因的染色体突变，导致氨基酸替换，从而降低磺胺类药物的结合亲和力[8][9]。此外，已经发现了四种获得的磺胺类药物抗性基因：、、和[10][11]。这些基因主要存在于磺胺类药物抗性的革兰氏阴性细菌中，通常位于质粒和整合子等移动遗传元件上。基因分布最广，是全球最常见的ARGs之一[12]。它通常嵌入到1类整合子中，常与其他ARGs共存，这种配置促进了多重耐药性的发展。基因在移动平台上的携带使其可以通过接合和转化在细菌菌株和物种之间水平转移，成为抗生素抗性快速传播的关键驱动因素[13][14]。
目前，ARGs的检测方法包括基于培养的传统药物敏感性测试和分子生物学方法[15][16][17][18]。在现有方法中，实时定量PCR（qPCR）常用于废水处理厂中检测ARGs[19][20]；然而，其定量准确性很大程度上依赖于标准曲线的构建和PCR扩增的效率。下一代测序（NGS）能够对ARGs、宿主和移动元件进行无目标分析[21][22]。然而，这种方法技术复杂、成本高昂，可能无法检测低丰度的目标基因[23]。数字PCR（dPCR）无需外部校准即可直接进行绝对核酸定量，显著提高了检测灵敏度，能够在土壤和废水等复杂基质中准确量化低丰度的基因[24][25]。在这种情况下，使用RM对于确保不同检测方法和实验室之间的可比性和可靠性至关重要。值得注意的是，由于其高灵敏度和绝对定量能力，dPCR常被用于RM的赋值。同样，高性能液相色谱-同位素稀释质谱法（HPLC-IDMS）通过准确测量目标分析物与稳定同位素标记内标之间的离子响应，实现了质粒分子的精确量化，Lee等人和Shibayama等人已经证明了这一点[26][27]。在本研究中，质粒DNA在IDMS分析前通过酶解成脱氧核苷一磷酸（dNMPs），使用经过认证的dNMPs参考物质（CRMs）作为校准标准，以实现可追溯和准确的量化。
我们进一步深入研究了影响IDMS测定核酸准确性的关键因素。具体而言，样品纯度是一个关键决定因素——游离核苷酸和寡核苷酸杂质被认为是导致定量偏差的潜在来源，从而导致结果偏高；而酶解程度需要精细调节，以实现完全消化而不引起过度降解。通过系统优化全面解决这些干扰变量，我们实施了结合IDMS和dPCR的双重定量策略，用于磺胺类药物抗性基因检测的质粒DNA RM的赋值。值得注意的是，这两种正交方法得出的定量结果表现出良好的一致性，从而验证了所建立方法的稳健性和准确性。
章节片段
质粒DNA RM的制备
基因的核苷酸序列（GenBank：DQ125241.2，位置4388–3549）从美国国家生物技术信息中心（NCBI）下载。重组质粒pUC57由杭州师范大学的Jin Zhigang教授提供。根据制造商的方案，使用Plasmid Maxi Kit（QIAGEN，目录号12,165）对质粒进行了培养、扩增和提取。通过BamHI-HF单酶消化进行了线性化处理
候选RM的鉴定
通过Sanger测序验证了质粒序列，确认其与预期构建物的一致性。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）评估了DNA浓度和纯度。测得的A260/A280比为1.8–2.0，A260/A230比超过2.0，证实了DNA的高纯度。使用Agilent 2100 Bioanalyzer和DNA 7500 Kit进行毛细管电泳分析，得到预期的质粒单峰
结论
总之，本研究通过开发和表征针对基因的质粒DNA RM，建立了ARGs量化的计量可追溯性。该方法结合了dPCR直接确定拷贝数和IDMS将DNA质量浓度转换为拷贝数浓度。所开发的RM表现出令人满意的均匀性和稳定性，满足了参考物质的关键性能要求。据我们所知，这项工作提供了首例
CRediT作者贡献声明
Jin Yang：数据管理、正式分析、研究、验证、撰写——原始草稿。Xia Wang：验证、研究。Yang Liu：研究、正式分析。Yunhua Gao：资源提供、项目管理。Chunyan Niu：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。Lianhua Dong：监督、资金获取。Jingya Yang：可视化、监督。
资助
本工作得到了中国国家重点研发计划（2023YFF0611004）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
