《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Discrimination of nanovesicles using two-color laser-induced fluorescence detection
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本文介绍了一种创新的双色荧光检测系统，该系统利用488 nm和635 nm两束激光，在方形毛细管内形成空间分离的片状聚焦光束，成功实现了对标记不同荧光染料的纳米囊泡（如脂质体和细胞外囊泡EVs）的鉴别与计数。研究不仅验证了该方法区分标记脂质体的能力，还将其应用于直接从HeLa和A549细胞培养基中区分CD63阳性的EVs，并研究了抗癌药物阿霉素对EVs分泌的影响。这项工作为EVs的快速、低成本分析提供了一种新工具，在疾病诊断和药物研发领域具有应用潜力。
在生命科学的前沿领域，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）正吸引着越来越多的目光。这些由细胞释放的、被脂质双层膜包裹的微小颗粒，大小从几十纳米到几微米不等，就像一个繁忙细胞社会中的“微型邮差”，承载着蛋白质、核酸等重要“信息”，在细胞间通讯中扮演关键角色。特别是其中一类被称为外泌体（exosomes）的小型EVs，它们与多种疾病的发生发展密切相关，包括癌症的进展、转移和治疗抵抗，因此被视为极具潜力的疾病诊断生物标志物和靶向药物递送载体。
然而，要从复杂的生物体液（如血液、尿液）或细胞培养液中精准地“捕捉”并研究这些微小的EVs，科学家们面临着巨大的挑战。首先，样本中通常混杂着多种类型的囊泡、细胞碎片乃至脂蛋白，要将目标EVs（例如表达特定表面蛋白CD63的外泌体）从中干净地分离并识别出来，非常困难。传统的分离方法如超速离心，不仅耗时、需要昂贵设备和大样本量，而且纯度有限。其次，在分析层面，常用的技术如纳米颗粒追踪分析（NTA）能测大小和数量但难以区分蛋白标志物；蛋白质印迹（Western blotting）步骤繁琐；流式细胞术则需要高度纯化的样本且仪器昂贵。因此，开发一种能够快速、简便、低成本地鉴别和计数不同亚型EVs的方法，成为了该领域一个迫切的需求。
为了应对这一挑战，来自日本冈山大学化学系的研究人员Shunsuke Asahi和Takashi Kaneta在《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》上发表了一项研究，他们开发了一种创新的双色激光诱导荧光检测系统，旨在实现对不同荧光标记的纳米囊泡进行直接鉴别和计数。
研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术方法：首先，自主搭建了一套核心检测系统，该系统使用488 nm和635 nm两台激光器，通过柱面透镜将光束整形为片状，并聚焦于方形毛细管内部两个空间分离的位置。其次，利用荧光标记的脂质体（Rhod-DPPE和Atto-DPPE标记）作为模型体系，对系统的鉴别和定量能力进行了验证。最后，从HeLa和A549两种癌细胞系的培养基中直接获取EVs样本，不经过复杂的纯化步骤，仅通过低速离心去除大碎片后，使用荧光标记的抗CD63抗体和一种能结合所有EVs膜的非选择性染料对样本进行双重标记，然后将样本引入毛细管，在重力驱动下流动，通过显微镜和CCD相机捕获囊泡依次通过两个激光区域时产生的荧光信号，从而实现CD63阳性EVs与其他EVs的区分和计数。研究还进一步用此系统评估了抗癌药物阿霉素对EVs分泌的影响。
研究结果部分主要包括以下几方面发现：
3.1. 使用荧光脂质体进行方法验证
研究人员首先用标记了不同荧光染料（Rhod和Atto）的脂质体验证了系统的性能。结果成功显示，Rhod标记的脂质体只在488 nm激光聚焦区域被检测到，而Atto标记的脂质体只在635 nm激光聚焦区域被检测到。通过分析按不同比例混合的两种脂质体，系统检测到的数量与预期混合比例高度吻合，证明了其同时定量和区分两种囊泡的能力。此外，对双标记（同时带有Rhod和Atto）脂质体的追踪，展示了系统如何通过囊泡在空间分离的激光束之间移动的轨迹来识别它们。
3.2. CD63阳性EVs与其他EVs的鉴别
将系统应用于真实的生物样本。研究人员从HeLa和A549细胞培养基中收集EVs，并用抗CD63-PE抗体（在488 nm激发下发出橙色荧光）和膜结合染料ExoSparkler Deep Red（在635 nm激发下发出远红光）进行标记。CD63是外泌体上常见的标志性蛋白。通过分析荧光信号出现的位置和时间顺序，可以区分出CD63阳性EVs（会在两个激光区域先后发光）和其他EVs（只在635 nm激光区域发光）。分析结果表明，在总EVs群体中，HeLa细胞释放的CD63阳性EVs比例约为3%，而A549细胞的比例约为9%。尽管存在高背景信号（来自未结合的游离染料），但EVs的荧光信号仍能被可靠识别。
3.3. 抗癌药物对EVs释放的影响
研究人员进一步探讨了抗癌药物阿霉素对EVs分泌的影响。用不同浓度的阿霉素处理HeLa和A549细胞后，利用该系统检测EVs的数量变化。结果显示，随着阿霉素浓度增加，细胞数量如预期般减少，但两种细胞释放的EVs总数以及其中CD63阳性EVs的数量均呈剂量依赖性增加。特别是在A549细胞中，CD63阳性EVs的比例从11%显著上升到27-28%。这一发现与之前关于抗癌药物可刺激EVs释放的报道一致。
综上所述，本研究的结论与讨论部分强调，这项研究成功开发并验证了一种基于双色激光诱导荧光的检测系统，该系统能够有效区分和定量两种不同类型的纳米囊泡。与传统的NTA和流式细胞术相比，该系统的优势在于其结构相对简单、成本较低，并且能够对未经复杂纯化的原始样本（如细胞培养基）进行直接分析，减少了样本处理步骤可能带来的损失和偏差。通过使用模型脂质体和来自癌细胞的真实EVs样本，研究证明了该系统在鉴别特定蛋白标志物（如CD63）阳性的EVs亚群方面的可行性。更重要的是，研究揭示了抗癌药物阿霉素能够促进癌细胞，尤其是A549细胞，释放更多EVs，并且其中CD63阳性EVs的比例显著升高，这为理解药物作用与细胞通讯（通过EVs）之间的关系提供了新的线索。
该研究的重要意义在于，它为EVs的快速、简便分析提供了一种有前景的新工具。尽管目前系统仅能区分两种颜色（即两种标志物），但其原理易于扩展。未来，通过引入更多不同波长的激光和对应的荧光标记抗体，该系统有望实现对多种EVs表面蛋白的同时检测，从而更精细地解析EVs的异质性。在精准医疗和疾病诊断领域，这种能够直接、快速分析临床样本中特定EVs亚群的技术，对于开发基于EVs的液体活检和疾病监测新方法具有重要的推动价值。当然，研究也指出了当前的一些局限性，例如未对脂质体进行详细的物理化学表征，且EVs的分析中无法完全排除非特异性染色的影响，这些都为未来的研究优化指明了方向。
