《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》：GC–MS Identification of Nilgirianthus ciliatus (Nees) Bremek. Leaf Extract with Anti-Inflammatory and Anti-Proliferative Activity in Lung Cells
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抗氧化活性|抗炎机制|肺纤维化治疗|Squalene|萨哈查拉叶提取物
帕万·库马尔·卡图库克（Pavan Kumar Katukukke）| 阿卡莎·巴尔纳杜佩特（Akarsha Balnadupete）| 艾琳娜·瓦鲁格塞（Aleena Varughese）| 基拉娜·穆加兰贾（Kirana Mugaranja）| 雅索达尔·P·班达里（Yashodhar P. Bhandary）| 马尼坎丹·拉梅什（Manikandan Ramesh）
印度泰米尔纳德邦卡拉伊库迪（Karaikudi）阿拉加帕大学（Alagappa University）科学校区生物技术系，邮编630003
摘要
Nilgirianthus ciliatus（Nees）Bremek（同义词：Strobilanthes ciliata Nees），在阿育吠陀（Ayurveda）、悉达（Siddha）和乌纳尼（Unani）医学体系中被称为Sahachara，在当地被称为Karim Kurunji，长期以来被用于喀拉拉邦（Kerala）和泰米尔纳德邦（Tamil Nadu）作为产后补品，用于缓解炎症性疼痛。在本研究中，首先通过GC–MS分析鉴定了N. ciliatus叶提取物（NCLE）中可通过GC检测到的主要成分，包括角鲨烯（squalene），然后进行了生物学评估。通过DPPH自由基清除试验和BSA变性试验首次评估了角鲨烯（SQ）和NCLE的抗氧化和体外抗炎活性。随后使用MTT试验、划痕试验（scratch assay）和AO/EtBr染色法在未经处理的A549细胞中检测了它们的细胞毒性和抗增殖作用。为了研究上皮细胞应激相关的炎症和纤维化反应，使用RT-PCR和免疫荧光技术分析了博来霉素（Bleomycin, BLM）诱导的A549细胞中IL-17、IL-23、TGF-β以及EMT标志物vimentin的表达。尽管A549细胞来源于上皮癌而非免疫细胞，但它们为研究上皮损伤、应激相关的炎症信号传导以及与肺部病理相关的纤维化反应提供了有用的体外模型。角鲨烯（SQ）和NCLE表现出剂量依赖性的抗氧化和抗炎活性。SQ降低了IL-23和TGF-β的表达，而NCLE则下调了vimentin的表达。AO/EtBr染色显示SQ处理过的细胞出现了混合类型的细胞死亡相关形态变化，NCLE处理过的细胞则出现了膜完整性丧失相关的荧光模式变化。总体而言，GC–MS鉴定的NCLE和SQ在该上皮体外模型中表现出互补的抗氧化、抗炎和抗增殖作用，尽管仍需通过药理学比较物和体内研究进一步验证。
引言
肺部炎症是慢性肺疾病（包括特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病COPD和急性肺损伤）发病机制中的关键早期事件。这是一种自然的宿主防御机制，会在感染、毒素和组织损伤等有害刺激下被激活，导致血管通透性增加、上皮细胞损伤以及炎症介质的释放，从而促进白细胞向受影响的肺组织迁移（Barnes 2011；Carlos等人2010）。当这种反应失调或持续存在时，就会引发炎症与纤维化重塑甚至肿瘤发展的连锁反应。
肺泡上皮细胞在早期应对肺部损伤中起着核心作用，它们能够感知有毒刺激，经历氧化应激和结构损伤，并参与炎症介质和促纤维化介质的释放或调节。在博来霉素诱导的上皮损伤中，细胞因子相关标志物（如IL-17、IL-23和TGF-β）以及EMT相关蛋白（如vimentin）的表达变化，可能反映了与早期炎症-纤维化连续过程相关的上皮细胞应激反应。TGF-β信号传导的失调进一步促进了EMT、成纤维细胞激活和细胞外基质的沉积，这些都是纤维化重塑的标志。博来霉素是一种化疗药物，在癌症治疗中广泛应用，同时也因其剂量限制性的肺毒性而被用作诱导肺部炎症和纤维化的经典且高度可靠的实验模型。博来霉素会引起氧化应激、DNA损伤和炎症细胞因子的释放，导致肺泡上皮损伤，并出现临床上的肺部炎症和早期纤维化表现。在基于上皮细胞的系统中，博来霉素暴露会引起氧化应激、上皮损伤以及炎症和纤维化相关标志物（如IL-17、IL-23、TGF-β和vimentin）的表达变化，从而提供了一个有用的体外模型，用于研究与早期肺部损伤和纤维化重塑相关的上皮细胞反应。如果这种炎症状态得不到解决，将会进展为胶原蛋白沉积、纤维化瘢痕形成以及微环境变化，这些变化可能会促进肿瘤的发生和发展。
尽管目前已有抗纤维化和抗炎药物（如尼达尼布nintedanib和吡非尼酮pirfenidone）可用，但它们的疗效有限且伴有显著的不良反应。因此，迫切需要多靶点、安全的药物。药用植物仍然是这类化合物的重要来源，因为许多现代药物直接来源于植物代谢物或天然骨架（Dzoyem & Eloff, 2015；Gurib-Fakim, 2006；Heinrich等人, 2020；Kola等人, 2022；Ramawat等人, 2009）。植物中的多种化学物质，包括黄酮类、萜类和酚类化合物，构成了它们在抗炎和呼吸系统疾病治疗中的广泛应用基础（Adam等人, 2020；Heinrich等人, 2020）。
Sahachara，也称为Nilgirianthus ciliatus（Nees）Bremek（同义词：Strobilanthes ciliata Nees），是一种生长在西高止山脉（Western Ghats）的灌木，常用于阿育吠陀和悉达医学中，用于治疗炎症、呼吸系统疾病、伤口愈合、支气管炎和肿胀（Anusree Prakash和Nishtha, 2022；Astanga Hridaya – Chikitsa Sthana 21/26–30；Bhaishajya Ratnavali；Sahasrayoga；Nair等人, 2016；Srinivasan等人, 2013；Warrier, 1993；Varghese等人, 2014；Venkateswarlu, 2023；Nayagam等人, 2023）。植物化学研究表明，黄酮类、酚类和萜类化合物（包括角鲨烯（SQ）、lupeol和stigmasterol）是N. ciliatus的主要次生代谢物，具有已证实的抗氧化、抗炎和免疫调节作用（Rameshkumar等人, 2018；Renjana, 2014）。我们研究小组之前的研究还分析了N. ciliatus的GC-MS谱型、HPTLC指纹图谱和DNA指纹图谱（Kumar等人, 2025）。角鲨烯（SQ）因其单线态氧淬灭、脂质膜保护、炎症途径调节和抗癌作用而尤为重要（Huang等人, 2009；Lou Bonafonte等人, 2018；Micera等人, 2020）。其重要性还扩展到了作为COVID-19疫苗佐剂的用途（Ho等人, 2021；Dasari等人, 2025）。通过GC–MS和HPTLC分析多种基因型后，确认N. ciliatus的主要三萜成分是SQ（Kumar等人, 2025）。新兴证据表明，N. ciliatus提取物及其相关生物活性成分可以调节与肺损伤相关的关键炎症、氧化和促纤维化途径。
然而，对N. ciliatus在博来霉素诱导的上皮损伤和早期纤维化相关反应中的治疗潜力的系统评估仍然有限。基于其传统的药用价值和已报道的植物化学成分，我们假设N. ciliatus叶提取物（NCLE）及其关键三萜成分角鲨烯（SQ）可以调节博来霉素暴露引发的上皮细胞应激相关的炎症和纤维化信号通路。因此，本研究旨在使用A549细胞模型评估NCLE和SQ的保护作用。具体而言，研究了它们对选定的炎症和纤维化相关标志物（IL-17、IL-23、TGF-β和vimentin）的影响，以探索它们在调节炎症-纤维化连续过程中的潜在作用。
材料
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Himedia，印度），BSA（Himedia，印度），DPPH（Himedia，印度），胎牛血清（FBS；Himedia，印度），抗生素溶液（Himedia，印度），博来霉素（BIOCHEM Pharmaceutical Industries Limited，印度），MTT（Himedia，印度），抗IL-17、抗IL-23、抗TGF-β、抗vimentin的一抗（CST，美国）以及抗兔过氧化物酶标记的二抗（CST，美国），纯度98%的角鲨烯（Sigma Aldrich-Merck，印度），A549细胞系
N. ciliatus
N. ciliatus植物采集自印度卡纳塔克邦（Karnataka）的Chikmagaluru地区（坐标13°12'37.1"N 75°15'34.0"E，海拔155米）。采集的基因型由印度泰米尔纳德邦Tiruchirappalli市St Joseph's College的Rapinat标本馆主任L. John Peter Arulanandam博士鉴定，标本编号为RHT 69003。
叶提取物的制备和角鲨烯的提取
叶提取物采用索克斯莱特提取法（Soxhlet extraction method）制备。具体来说，2克干燥的叶粉用250毫升甲醇提取8小时。
角鲨烯（SQ）和NCLE的自由基清除及抗炎活性
各种外源性氧化剂和污染物在激活肺部炎症细胞以及诱导不同类型的活性氧（ROS）和活性氮物种（RNS）方面起着重要作用，尤其是在肺部炎症状态下。此外，氧化剂/抗氧化剂的平衡和细胞的氧化还原状态对肺纤维化（PF）的进展也至关重要（Kinnula等人, 2005）。本研究使用DPPH自由基清除试验评估了NCLE和SQ的抗氧化潜力。
讨论
在本研究中，我们评估了体外抗氧化、抗炎和抗增殖特性，发现SQ和NCLE都具有显著的生物活性，这些活性可能通过不同的但互补的机制发挥作用。本研究揭示了SQ和NCLE在治疗肺纤维化（PI）和肺纤维化（PF）方面的潜力。
在MTT和迁移试验中，SQ和NCLE在A549细胞中均表现出显著的抗增殖和细胞毒性作用。
结论
总之，本研究表明了角鲨烯（SQ）和N. ciliatus叶提取物的抗氧化、抗炎和抗增殖潜力。SQ在下调选定的炎症和纤维化标志物方面更为有效，表明其在调节上皮细胞应激相关反应方面的潜力。相反，NCLE也下调了炎症标志物，并显著降低了vimentin的表达，这可能与调节EMT相关过程有关。
CRediT作者贡献声明
阿卡莎·巴尔纳杜佩特（Akarsha Balnadupete）：撰写原始草稿、数据可视化、验证、方法学设计、实验实施、数据分析、数据管理。帕万·库马尔·卡图库克（Pavan Kumar Katukukke）：撰写原始草稿、数据可视化、验证、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构建。基拉娜·穆加兰贾（Kirana Mugaranja）：撰写原始草稿、数据可视化、验证、实验实施、数据分析。艾琳娜·瓦鲁格塞（Aleena Varughese）：撰写原始草稿、数据可视化、实验实施、数据分析。
未引用参考文献
Adams和Yakubu, 2020; Alzohairy等人, 2021; Ambriz-Perez等人, 2016; Sostres等人, 2010; Elhady等人, 2024; Geronikaki和Gavalas, 2006; Jing等人, 2022; Khazri等人, 2022; Luke等人, 2024; Martinez等人, 2008; Nair等人, 2016; Punithavathi等人, 2000; Rajamma等人, 2020; Turgut等人, 2016; Wang等人, 2021; Wihadmadyatami等人, 2019; Zhang等人, 2023; Zhang等人, 2020; Zhang等人, 2024; Astanga Hridaya, Sahasrayoga等。
数据可用性
支持本研究结果的原始数据见本文附带的补充信息。
资助
本研究未获得任何公共部门、商业机构或非营利组织的资助。
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
所有作者衷心感谢Yenepoya研究中心的实验室和仪器设施（Yenepoya被视为大学），以及Yenepoya医学院和医院的专业研究部门（Mangalore，卡纳塔克邦）。作者还感谢RUSA 2.0 [F.24-51/2014 - U, Policy (TN Multi-Gen), 教育部, GOI]的支持。作者同时感谢卡纳塔克邦林业部门及Mangalore的森林副主管Dinesh Kumar Y. K.博士。
