机器学习辅助的等离子体代谢组学方法识别出用于结直肠癌检测的五种代谢物组合

《ACS Omega》：Machine Learning-Assisted Plasma Metabolomics Identifies a Five-Metabolite Panel for Colorectal Cancer Detection

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结直肠癌（CRC）仍然是全球癌症相关死亡的主要原因之一，迫切需要改进非侵入性的早期检测策略来补充当前的筛查方法。我们应用了一种综合的等离子体代谢组学工作流程，该流程结合了非靶向和靶向液相色谱-质谱与机器学习辅助的特征优先级排序。分析了172名CRC患者和115名健康对照者的血浆样本，并在另一个由47名CRC患者和47名健康对照者组成的独立队列中进行了验证。从146,880个光谱特征中，使用随机森林算法对特征进行了可靠的排序，随后进行了基于ROC的优先级排序和代谢物注释。通过逻辑回归模型评估了诊断性能。进行了表型测定，以评估选定的代谢物在CRC细胞模型中的生物活性。在两个队列中，五种代谢物N-甲基胞苷、2-哌啶酮、茶碱、dl-诺莱辛酸和亚油酸在CRC患者血浆中的水平一致降低。这种综合的五种代谢物组合在验证队列中的ROC曲线下面积为0.968，灵敏度为97.9%，特异性为89.4%，准确率为93.7%。分层分析显示了其在不同疾病阶段和年龄组的稳健性。体外测定表明，在非细胞毒性条件下，这些代谢物可以调节CRC细胞的迁移和侵袭。这种五种代谢物的血浆特征反映了与CRC相关的系统性代谢变化，并显示出强烈的区分能力。该组合物可以通过有助于CRC风险分层和早期检测来补充现有的筛查方法。

1. 引言
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。根据最近的全球估计，每年新诊断出超过190万例病例，死亡人数超过90万。(1) CRC通常在5-10年内从腺瘤性息肉发展成侵袭性癌，(2?5) 这为早期检测和干预提供了关键的时间窗口，从而显著提高生存率。目前的CRC诊断方法存在显著局限性。结肠镜检查仍然是金标准，因为它具有高灵敏度和去除癌前病变的能力；(6?10) 然而，它具有侵入性、资源密集性，并且与患者不适和程序风险相关。非侵入性替代方法，如粪便隐血试验和粪便免疫化学试验，虽然更容易获得，但对早期肿瘤的灵敏度不够理想，并且容易受到非癌相关出血的假阳性影响。(11?19) 这些缺点突显了需要具有改进诊断性能的补充性非侵入性生物标志物的需求。基于血液的分子生物标志物在可访问性、重复性和客观性方面具有优势。(20,21) 常见的CRC标志物如癌胚抗原（CEA）和碳水化合物抗原19-9（CA19-9）有助于监测疾病进展和治疗反应(22?24)，但缺乏用于初级筛查或早期检测的灵敏度和特异性。这突显了持续寻找新的生物标志物策略的必要性，以识别更可靠的CRC指标。代谢组学已成为癌症和其他疾病生物标志物发现的有价值的工具。作为基因组学、转录组学和蛋白质组学过程的下游输出，代谢组反映了功能、生理和病理状态。(25?28) 液相色谱-质谱（LC–MS）的进步使得能够以高灵敏度和特异性全面分析生物流体中的小分子代谢物。非靶向和靶向代谢组学方法已成功应用于识别潜在的生物标志物并阐明CRC的机制。(29?31) 将机器学习与代谢组学数据分析相结合，可以处理高维数据集并改进特征选择和模式识别。(32) 随机森林算法在代谢组学研究中得到广泛应用，因为它们对过拟合具有鲁棒性，并且能够对特征重要性进行排序。(33?35) 随机森林算法通过构建多个决策树并汇总它们的预测，从而减少了过拟合并提高了在不同患者群体中的泛化能力。尽管粪便免疫化学试验（FIT）和血清癌胚抗原（CEA）仍广泛用于结直肠癌（CRC）的筛查和监测，但两种方法都有其局限性。FIT的性能受到间歇性出血的影响，对早期疾病的灵敏度降低，而CEA在人群水平筛查中的灵敏度和特异性不足。新兴的基于血液的检测方法，包括循环肿瘤DNA和基于甲基化的组合，提供了有希望的进展，但往往需要复杂的工作流程，并且在常规临床环境中仍然成本高昂或难以实施。在这种情况下，血浆代谢组学是一种补充策略，可以捕捉与肿瘤存在和宿主-微生物组相互作用相关的系统性代谢变化。鉴于结直肠癌的发生常常伴随着显著的肠道微生物组失调和与恶病质相关的代谢重编程，我们假设宿主-微生物代谢物的系统耗竭可以作为早期疾病检测的敏感标志物。与其取代现有的筛查工具，基于代谢物的生物标志物可以提供额外的生物学信息，以增强风险分层和支持临床决策。

在这项研究中，我们应用了一种综合的多平台代谢组学工作流程，结合了非靶向和靶向LC–MS分析与机器学习，来分析CRC患者和健康对照者的血浆样本。我们的目标是识别和验证一组具有潜在非侵入性CRC检测用途的血浆代谢物生物标志物。我们还评估了选定代谢物的表型效应，以了解它们在CRC中的生物学相关性。

2. 结果
2.1 使用随机森林算法和接收者操作特征分析进行代谢物特征选择
为了识别CRC患者和健康个体之间的差异代谢物，我们分析了两个独立队列的血浆样本。来自NCKUH的发现队列包括172名CRC患者和115名健康志愿者。相比之下，E-Da医院的独立验证队列包括47名CRC患者和47名健康志愿者（详细的临床特征见表1）。我们使用LC–MS结合机器学习的综合代谢物生物标志物识别工作流程如图1所示。原始的高分辨率质谱数据经过系统处理，包括保留时间对齐和相对于内标的信号强度标准化。这种严格的处理产生了所有样本中的146,880个独特的光谱特征。为了消除特征选择中的主观偏差，随机森林模型使用了20棵树，在与50棵树和100棵树比较后进行了选择，这两种方法的准确率相似（差异<1%），但计算成本更高（图S1）。

表1. 发现队列和验证队列的研究参与者的 demographics 和临床特征
发现组 验证组 健康志愿者 CRC患者 健康志愿者 总计
男性 56 9 3 172 47 47
女性 59 7 3 172 47 47
年龄 <60 107 4 14 22 1
≥60 81 7 2 6 26
平均值 ± 标准差（范围） 40 ± 12.08 (24–68) 71 ± 9.47 (29–93) 34 ± 12.54 (22–66) 61 ± 11.39 (30–88)
中位数 37 7 2 30 61

图1. 结直肠癌生物标志物发现和验证的多平台代谢组学工作流程。该综合流程概述了一个系统的生物标志物开发方法：(A) 发现阶段结合高分辨率质谱与随机森林算法，从CRC和对照血清中无偏选择特征；(B) 目标分析阶段使用ROC曲线评估和数据库注释来识别具有临床相关性的代谢物候选者；(C) 功能验证通过基于细胞的测定来建立代谢物对CRC细胞迁移、侵袭和增殖的影响的生物学相关性；(D) 临床验证通过在独立患者队列中的定量和统计分析来确认诊断效用。这种综合工作流程结合了基于机器学习的特征选择、定量代谢组学和表型效应，以识别和验证具有早期CRC检测潜力和生物学意义的稳健代谢物生物标志物。

2.2 使用随机森林分析对CRC相关代谢物特征进行稳健的优先级排序
鉴于非靶向LC–MS代谢组学数据的高维度，我们的目标不是建立单一的优化黑盒分类器，而是优先选择能够在多个采样划分中一致区分CRC患者和健康对照者的代谢物特征。通过对十个随机划分的特征子集独立应用随机森林分析，我们识别出1007个能够可靠区分CRC和对照样本的特征。在发现队列内的内部验证显示出了强大的分类性能（准确率为97.7%），证实所选特征集保留了大量的区分信息（图2A）。这种性能反映了特征集的可分离性，而不是最终的诊断建模。正交偏最小二乘-判别分析进一步基于这些特征显示了CRC和健康血浆代谢组轮廓之间的明显分离（图2B），排列测试确认了模型的稳健性（图2C）。

图2. 基于机器学习的CRC生物标志物发现特征选择。(A) 混淆矩阵评估随机森林算法选择的特征的性能。在发现队列样本的30%（N = 87）上进行的模型验证实现了97.7%的准确率和98.1%的F1分数，表明了强大的分类性能。(B) OPLS-DA分数图显示了发现队列中CRC患者（红色）和健康个体（绿色）的1007个特征的不同代谢轮廓。(C) 100次排列的排列测试结果，p < 0.01，累积R2Y和Q2值分别为0.964和0.95，证实了模型的有效性。(D) 火山图通过随机森林分析显示了1007个选定特征的意义和倍数变化分布，突出显示了CRC患者中上调的277个特征（红色点）和下调的543个特征（蓝色点）。

随后的火山图分析表明，大多数区分特征在CRC血浆样本中下调，表明与疾病状态相关的全球性代谢抑制（图2D）。为了优先选择具有最大转化潜力的特征，进行了ROC分析，AUC >0.90的特征被保留用于代谢物注释。这个过程产生了18个高置信度的代谢物注释，从中选择了五种商用的代谢物进行定量验证和表型效应。我们在发现队列上使用5折交叉验证来优化超参数、评估内部有效性并防止过拟合。

2.3 验证用于CRC检测的机器学习选择的代谢物候选者
为了验证和进一步表征，我们选择了五种商用的注释代谢物：N-甲基胞苷、2-哌啶酮、茶碱、dl-诺莱辛酸和亚油酸。在发现队列中对这四种代谢物进行的初步ROC曲线分析显示出了出色的诊断潜力，除了dl-诺莱辛酸外，其余四种的AUC值均超过了0.95（图S2）。为了确保准确的量化，我们建立了浓度标准曲线来测量这两组样本中的这些化合物。在独立验证队列中，使用散点图和ROC曲线分析严格评估了这五种代谢物的诊断性能（图3A–E）。值得注意的是，这五种代谢物在CRC患者中的浓度明显低于健康对照组。这种在发现队列和验证队列中的一致模式加强了它们作为可靠CRC生物标志物的潜力。

2.4 不同人群和临床亚组中候选代谢物的稳健性
我们进一步分析了这些代谢物在不同CRC阶段中的浓度，详情见表2。除了N-甲基胞苷在验证队列中的AUC值相对较低外，其他四种代谢物在所有CRC阶段中的浓度均一致降低。值得注意的是，代谢物水平与癌症进展之间的相关性分析显示，dl-诺莱辛酸的浓度随着癌症阶段的进展而逐渐降低（图4A–E），表明其作为分期生物标志物的潜力。

表2. 验证队列中不同CRC阶段候选代谢物的定量
代谢物 浓度 AUC p值 切割值 敏感性 特异性 准确率
CRC患者 健康志愿者
N-甲基胞苷 4.15 ± 1.15 ng/mL 7.82 ± 1.81 ng/mL 0.6903 0.046 93.6%
2-哌啶酮 54 2.14 ± 11 1.00 ng/mL 396 3.58 ± 39 71.8%
茶碱 23.00 ± 8.04 μg/mL 44 6.40 ± 44 0.9389 <0.0001 44.11 μg/mL 85.1%
dl-诺莱辛酸 97.05 ± 10.03 μg/mL 21 15.38 ± 11 0.9013 <0.0001 113 9.63 μg/mL
亚油酸 3.91 ± 0.55 μg/mL 73.88 ± 17.00 μg/mL 0.7592 <0.0001 17.82 μg/mL 89.4%
a 不同CRC阶段（I–IV）中五种代谢物的血浆浓度与健康对照组的比较。数据表示为平均值 ± 标准差，统计显著性由适当的统计测试的p值指示。

图4. CRC进展过程中候选代谢物浓度的分阶段变化。(A) N-甲基胞苷，(B) 2-哌啶酮，(C) 茶碱，(D) dl-诺莱辛酸，(E) 亚油酸的血浆浓度，按CRC阶段（I至IV）分层，并与健康对照组进行比较。散点图中的水平线代表平均值，显示了每种代谢物的阶段特异性浓度模式。dl-诺莱欣（dl-Norleucine）的浓度随着癌症阶段的进展而显著下降（p < 0.05），这突显了其作为分期生物标志物的潜力。所有代谢物在CRC患者中的浓度都显著低于健康对照组，且存在与阶段相关的变化，这些变化可能反映了潜在的疾病机制。高清晰度图像下载MS PowerPoint幻灯片

为了评估人口统计因素是否干扰了所识别的代谢物变化，我们按年龄、性别、肿瘤位置和疾病阶段检查了血浆代谢物浓度。重要的是，在早期（I-II期）和晚期（III-IV期）疾病中，五种代谢物中有四种（2-哌啶酮、茶碱、dl-诺莱欣和亚油酸）在CRC患者中的浓度仍然显著低于健康对照组（图5A），表明它们的区分能力不仅限于晚期癌症。图5

图5. CRC患者中候选代谢物水平的比较分析。散点图显示了根据（A）疾病进展分层的五种已识别代谢物的分布——将健康对照组与早期（I-II期）和晚期（III-IV期）CRC患者进行比较。四种代谢物（N-甲基胞嘧啶除外）在早期和晚期CRC中的水平都显著低于健康对照组，且两个阶段之间没有显著差异。（B）原发肿瘤位置——通过解剖位置的分析未发现代谢物浓度的显著差异。（C）性别分布——dl-诺莱欣是唯一在男性和女性CRC患者中浓度有显著差异的代谢物（p = 0.0248）。（D）年龄分层——以中位年龄（61岁）为分界点，只有N-甲基胞嘧啶在不同年龄组间显示出显著的浓度差异（p = 0.0160）。水平线代表平均值，星号表示统计显著性（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。高清晰度图像下载MS PowerPoint幻灯片

使用中位年龄作为分界点进行的年龄分层分析显示，大多数代谢物在不同年龄组中的浓度模式一致，且在CRC患者中2-哌啶酮、茶碱、dl-诺莱欣或亚油酸未观察到显著的年龄依赖性差异（图5B）。相比之下，N-甲基胞嘧啶显示出适度的年龄相关变化，表明年龄相关的代谢因素可能部分影响了其诊断贡献。基于性别的分层显示对代谢物浓度的影响很小，除了dl-诺莱欣在男性和女性CRC患者中显示出适度但统计上显著的差异（图5C）。按原发肿瘤位置分层时未观察到显著差异（图5D）。总的来说，这些分析表明，这五种代谢物在多种患者群体中表现出良好的稳健性，支持它们作为CRC相关生物标志物的潜力。

鉴于发现队列中的CRC患者（71 ± 9岁）和健康对照组（40 ± 12岁）之间存在显著的年龄差异，我们试图验证观察到的代谢物水平降低是否由与年龄相关的生理变化所驱动。在我们的多变量逻辑回归模型中，调整了年龄因素后，五种代谢物中有四种（2-哌啶酮、茶碱、dl-诺莱欣和亚油酸）仍然具有统计显著性（p < 0.05），确认了它们作为CRC独立预测因子的地位（图S3）。与健康对照组中缺乏年龄依赖性一致，茶碱在调整年龄和性别后仍然与CRC状态显著相关（图S4）。N-甲基胞嘧啶在调整年龄后的预测能力有所减弱，这与我们的分层分析结果一致（图5B），表明可能存在与年龄相关的变化。此外，当单独分析健康对照组时，未发现年龄与2-哌啶酮、茶碱、dl-诺莱欣或亚油酸的血浆水平之间有显著相关性，这表明这些标志物与正常的时间老化无关。

2.5. 集成五代谢物面板提高了CRC检测的准确性

虽然单个代谢物显示出诊断潜力，但我们假设多标记物方法将提供更稳健和全面的CRC状态评估。在验证队列中的定量分析证实，所有五种机器学习选定的代谢物（N-甲基胞嘧啶、2-哌啶酮、茶碱、dl-诺莱欣和亚油酸）在CRC患者中的浓度均显著低于健康对照组。值得注意的是，其中三种代谢物的AUC值超过了0.9（图4和表2），显示出出色的区分能力。为了开发一个集成诊断模型，我们使用逻辑回归分析结合了这五种代谢物的信息。这种方法使我们能够通过利用每种生物标志物的互补信息来确定代谢物浓度与CRC存在概率之间的关系。模型系数是从训练集中得出的，然后应用于根据特定代谢物谱预测个体病例的CRC概率。使用混淆矩阵评估了该逻辑回归模型的性能，将预测分类与实际临床诊断进行比较（图6A）。在测试集（包含验证队列的30%，N = 29）上进行评估时，模型的准确率为86.2%，显示出其在估计CRC概率方面的有效性。对整个验证队列的更全面评估显示，五代谢物面板实现了令人印象深刻的AUC为0.9679（95% CI, 0.9250–0.999），灵敏度为97.9%（95% CI, 88.9%–99.9%），特异性为89.4%（95% CI, 76.9%–96.5%），总体准确率为93.7%（95% CI, 86.2%–98.1%）（图6B）。重要的是，这种集成代谢物面板的性能明显优于任何单个代谢物，证实了多标记物方法的价值。高灵敏度（97.9%）尤其值得注意，因为它表明该面板能够以最小的假阴性率正确识别CRC病例，这对有效的筛查工具至关重要。这些结果共同表明，我们的机器学习衍生的代谢物面板为非侵入性CRC检测提供了一种有前景的方法，具有在筛查和诊断中的潜在应用。

2.6. CRC相关代谢物对CRC细胞增殖和迁移的表型效应

为了探索我们在血浆代谢组学分析中识别的CRC相关代谢物的生物学相关性，我们使用HCT116和T5088结直肠癌细胞系评估了它们对与肿瘤进展相关的癌细胞表型的影响，包括增殖、迁移和伤口闭合。在健康供体血浆中观察到的浓度下，这五种代谢物均未显著改变HCT116细胞的增殖，表明在生理相关条件下其细胞毒性很小（图7A）。相比之下，T5088细胞对较高浓度的N-甲基胞嘧啶和茶碱表现出剂量依赖性的敏感性，这表明是细胞系特异性的代谢反应，而不是普遍的抗增殖效应（图7B）。图7

图7. 候选代谢物对结直肠癌细胞增殖的影响。剂量依赖性的CCK-8增殖实验评估了五种已识别代谢物对（A）HCT116和（B）T5088 CRC细胞系的潜在细胞毒性效应。细胞在24小时内接受了逐渐增加浓度的N-甲基胞嘧啶、2-哌啶酮、茶碱和亚油酸处理，涵盖了生理相关水平到较高的实验剂量。结果显示为细胞存活率百分比。虽然生理相关浓度对HCT116增殖的影响很小，但N-甲基胞嘧啶和茶碱对T5088细胞表现出显著的剂量依赖性细胞毒性，表明这些代谢物对细胞系有特定的反应。高清晰度图像下载MS PowerPoint幻灯片

虽然对增殖的影响有限，但我们的研究表明它们对癌细胞侵袭和转移能力有更显著的影响。使用Transwell迁移实验，我们发现2-哌啶（4 μg/mL）、茶碱（450 μg/mL）、dl-诺莱欣（220 μg/mL）和亚油酸（70 μg/mL）处理显著抑制了HCT116细胞的迁移能力（图8A）。同样，N-甲基胞嘧啶（8 ng/mL）、2-哌啶（4 μg/mL）和茶碱（450 μg/mL）显著抑制了T5088细胞的迁移（图8B），进一步支持了这些代谢物对迁移相关表型的调节作用。补充的伤口愈合实验也证实了这些发现。所有五种代谢物都对HCT116细胞迁移具有抑制作用，与对照组相比，伤口闭合显著减少（图9A）。在T5088细胞中，茶碱的迁移抑制作用最强，而N-甲基胞嘧啶和亚油酸显示出中等但统计上不显著的抑制作用。2-哌啶和dl-诺莱欣对T5088细胞的伤口愈合影响可以忽略不计（图9B）。图8

图8. 候选代谢物对CRC细胞迁移的影响。Transwell迁移实验评估了已识别代谢物生物标志物对癌细胞运动的功能效应。（A）HCT116和（B）T5088 CRC细胞系在生理相关浓度下接受了N-甲基胞嘧啶（8 ng/mL）、2-哌啶酮（4 μg/mL）、茶碱（450 μg/mL）、dl-诺莱欣（220 μg/mL）和亚油酸（70 μg/mL）的处理，持续时间为18小时。左侧面板：结晶紫染色的迁移细胞代表照片。右侧面板：迁移细胞的定量分析，以对照组的百分比表示。在HCT116细胞中，2-哌啶、茶碱和亚油酸显著抑制了迁移，而在T5088细胞中，2-哌啶、茶碱和dl-诺莱欣表现出显著的抗迁移效应。统计显著性分别表示为*p < 0.05、**p < 0.01和***p < 0.001。这些发现表明，在CRC患者中这些代谢物水平的降低可能有助于增强迁移相关表型的调节。高清晰度图像下载MS PowerPoint幻灯片

图9. 通过伤口愈合实验评估的候选代谢物对CRC细胞运动的影响。Scratch-wound愈合实验评估了已识别的血浆代谢物生物标志物对癌细胞迁移的影响。（A）HCT116和（B）T5088 CRC细胞系在生理相关浓度下接受了N-甲基胞嘧啶（8 ng/mL）、2-哌啶酮（4 μg/mL）、茶碱（450 μg/mL）、dl-诺莱欣（220 μg/mL）和亚油酸（70 μg/mL）的处理，持续时间为24小时。代表性显微照片显示了0小时和24小时后的伤口闭合情况。HCT116和T5088细胞的伤口闭合率定量分析以对照组的百分比表示。在HCT116细胞中，所有五种代谢物均显著抑制了伤口闭合和迁移，而在T5088细胞中，只有茶碱表现出显著抑制作用，N-甲基胞嘧啶和亚油酸显示出中等但不显著的抑制作用。2-哌啶和dl-诺莱欣对T5088迁移的影响可以忽略不计。统计显著性分别表示为*p < 0.05、**p < 0.01和***p < 0.001。这些结果结合Transwell实验的结果，加强了这些代谢物在调节CRC转移行为方面的潜在生物学意义，表明在CRC患者中这些代谢物水平的降低可能有助于增强肿瘤侵袭性。

总之，这些发现表明，在CRC患者血浆中减少的多种代谢物在体外维持了能够调节癌细胞运动相关表型的生物活性，为观察到的代谢组学变化提供了生物学背景，但没有建立循环代谢物水平与体内肿瘤行为之间的直接机制或因果关系。

3. 讨论

在解释本研究的机器学习部分时，有几个方法学考虑因素是相关的。我们没有采用复杂或不透明的算法来追求最大的预测性能，而是采取了一种保守策略，强调特征的稳健性、生物学可解释性和转化相关性。随机森林分析仅用于高维代谢组学数据中的特征优先级排序。最终诊断模型依赖于在独立队列中测量的定量代谢物的逻辑回归。这种设计通过将特征发现与分类器构建分开，并避免在验证数据上重复模型优化，从而减少了过拟合的风险。虽然其他机器学习方法可能会在分类性能上带来边际提升，但这样的提升往往以降低可解释性和增加数据集特定偏差的风险为代价。相比之下，我们优先考虑了可重复的、生物学上合理的、未来临床检测开发兼容的代谢物特征。我们的代谢组学分析确定了五种代谢物，N-甲基胞嘧啶、2-哌啶酮、茶碱、诺莱欣和亚油酸，在CRC患者中的浓度始终低于健康对照组。这些发现，加上我们证明它们对癌细胞侵袭和迁移的抑制作用的功能研究，为CRC发病机制和早期检测的潜在生物标志物提供了新的见解。

N-甲基胞嘧啶是一种天然化合物，存在于如Thermopsis lanceolata和Sophora chrysophylla等植物中，具有多种药理特性，包括镇痛、抗糖尿病和抗炎作用。（36,37）在传统中医中，N-甲基胞嘧啶是草药Kushen的成分，已被用于治疗非小细胞肺癌。（38,39）我们的研究首次证明了它在CRC检测中的潜在作用，表现为在CRC患者中的水平低于健康对照组。此外，我们的功能分析显示这些代谢物对结直肠癌（CRC）细胞的迁移具有抑制作用，这表明它们除了作为生物标志物外，还可能具有潜在的生物学意义。2-哌啶酮（δ-戊内酰胺）是哌啶的衍生物，此前已有研究报道在卵巢癌患者的血浆中其含量较低（40-43），这与我们在CRC患者中的发现一致。重要的是，2-哌啶酮是由胃肠道细菌产生的（44,45），这表明它与肠道微生物群有关，而肠道微生物群在结直肠癌的发生中起着重要作用。我们在功能研究中观察到的2-哌啶酮对CRC细胞迁移和侵袭的抑制作用暗示了一种潜在的保护机制，而在该代谢物水平较低的CRC患者中，这种机制可能会受到损害。

茶碱（1,3-二甲黄嘌呤）通常用作呼吸系统的支气管扩张剂（46），先前的研究已证明其对CRC和乳腺癌细胞具有抗增殖作用（47-49）。最近的研究开发了算法，以探索茶碱在癌症治疗中的新应用（46-48）。将茶碱鉴定为下调的生物标志物需要仔细的生物学解释。虽然茶碱在临床上被用作支气管扩张剂，但在普通人群中，血液中的茶碱主要来源于细胞色素P450酶CYP1A2对膳食咖啡因的代谢。因此，在CRC患者中观察到的茶碱水平下降可能反映了由于疾病导致的食欲变化而减少的甲基黄嘌呤（咖啡和茶）摄入量。然而，我们甚至在早期阶段（I期）的患者中也观察到了茶碱水平的下降，而这些患者通常不会表现出晚期恶性肿瘤常见的严重厌食或“病态行为”。或者，这种下降可能反映了全身性的代谢重编程。CYP1A2的活性会被全身性炎症和细胞因子（如IL-6）下调，而这些因子在CRC中通常升高。因此，较低的血浆茶碱水平可能反映了宿主代谢抑制或肠道微生物群代谢甲基黄嘌呤能力的改变，而不仅仅是饮食习惯的变化。

诺莱辛（2-氨基己酸）是亮氨酸的一种异构体，之前已在人血中被检测到（42,43），在我们的分析中显示出一个与癌症阶段相关的有趣模式。随着CRC阶段的进展，诺莱辛浓度的逐渐下降表明它有可能作为分期的生物标志物，从而补充现有的疾病监测方法。诺莱辛与肠道细菌的关联（45）进一步加强了肠道微生物群与CRC发病机制之间的联系。我们新发现诺莱辛可以抑制癌细胞迁移，这为它在CRC进展中的潜在作用提供了功能上的解释。

亚油酸是一种必需的ω-3脂肪酸，由细菌合成，已有研究表明它可以抑制多种癌症类型的癌细胞增殖、粘附和侵袭（50）。最近的研究提供了亚油酸具有抗转移特性的直接证据（51）。我们在CRC细胞中的发现支持了这些抗转移效应，并表明CRC患者中亚油酸水平的降低可能促进了肿瘤的侵袭性。这再次表明了细菌代谢改变与CRC进展之间的联系。

本研究中的表型分析旨在评估与CRC相关的血浆代谢物是否表现出与癌细胞行为相关的生物学活性，而不是直接确定分子机制。几种在CRC血浆中减少的代谢物在体外调节了与迁移相关的表型，支持这些代谢物可能反映了影响肿瘤侵袭性的全身性代谢状态的观点。重要的是要强调，血浆代谢物可能作为宿主-肿瘤-微生物群相互作用的指标或中介物，而不仅仅是直接的肿瘤抑制剂。观察到的表型效应不应被解释为恢复循环代谢物水平可以直接抑制肿瘤进展的证据。相反，这些发现表明所鉴定的代谢物不仅仅是统计标志物，而是与改变的癌细胞行为相关的代谢环境的组成部分。此外，CRC细胞系之间的异质性突显了代谢物反应性的背景依赖性，进一步支持了循环代谢物水平反映的是更广泛的全身性或微生物群驱动的影响，而不仅仅是肿瘤内在机制。

在我们的分析中，Norleucine（2-氨基己酸）显示出最有趣的阶段依赖性模式。随着CRC阶段的进展，Norleucine浓度逐渐下降，这表明它有可能作为分期的生物标志物，从而补充现有的疾病监测方法。Norleucine与肠道细菌的关联进一步加强了肠道微生物群与CRC发病机制之间的联系。我们还发现Norleucine可以抑制癌细胞迁移，这为其在CRC进展中的潜在作用提供了功能背景。

亚油酸是一种必需的ω-3脂肪酸，由细菌合成，已有研究表明它可以抑制多种癌症类型的癌细胞增殖、粘附和侵袭（50）。最近的研究为它在骨肉瘤中的抗转移特性提供了直接证据（51）。我们在CRC细胞中的发现证实了这些抗转移效应，并表明CRC患者中亚油酸水平的降低可能促进了肿瘤的侵袭性。这代表了细菌代谢改变与CRC进展之间的另一个联系。

本研究中的表型分析旨在评估与CRC相关的血浆代谢物是否表现出与癌细胞行为相关的生物学活性，而不是直接确定分子机制。几种在CRC血浆中减少的代谢物在体外调节了与迁移相关的表型，支持这些代谢物可能反映了影响肿瘤侵袭性的全身性代谢状态的观点。重要的是要强调，血浆代谢物可能作为宿主-肿瘤-微生物群相互作用的指标或中介物，而不仅仅是直接的肿瘤抑制剂。观察到的表型效应不应被解释为恢复循环代谢物水平会直接抑制肿瘤进展的证据。相反，这些发现提供了生物学上的合理性，表明所鉴定的代谢物不仅仅是统计标志物，而是与改变的癌细胞行为相关的代谢环境的组成部分。此外，CRC细胞系之间的异质性突显了代谢物反应性的背景依赖性，进一步支持了循环代谢物水平反映的是更广泛的全身性或微生物群驱动的影响，而不仅仅是肿瘤内在机制。

在我们的研究中，识别出三种与细菌相关的代谢物（2-哌啶酮、Norleucine和亚油酸），突显了微生物群-代谢组轴在CRC中的重要性。鉴于越来越多的证据表明肠道菌群失调与CRC发病机制有关，这些代谢物可能作为连接改变的微生物群与癌症发展的功能中间体。如果没有配对的微生物群数据，这些联系仅仅是推测性的，需要进一步的研究，特别是关于这些代谢改变是CRC发病机制的结果还是促成因素。

从临床角度来看，我们的五种代谢物组合在独立验证队列中表现出稳健的诊断性能（准确率为93.7%，敏感性为97.9%，特异性为89.4%）。高敏感性对于需要最小化假阴性的筛查应用尤为重要。值得注意的是，该组合在早期CRC检测中保持了区分能力，满足了非侵入性筛查替代结肠镜检查的临床需求。

我们研究的几个方法学方面值得考虑。将无目标代谢组学与基于机器学习的特征选择相结合，提供了一种无偏见的生物标志物发现方法，降低了遗漏重要代谢改变的风险。在独立队列中的验证增强了我们发现的可靠性，尽管需要更大规模的多中心研究来确立更广泛的临床适用性。五种代谢物组合的诊断性能应结合现有的CRC筛查和基于血液的生物标志物来进行理解。血清CEA虽然有助于疾病监测，但对于早期CRC的敏感性有限，不建议作为独立的筛查工具。FIT提供了一种非侵入性替代方案，已被证明在人群层面有用，但受肿瘤出血模式的影响，并且对早期或非出血性病变的敏感性较低。

这里描述的血浆代谢物组合能够捕捉到与肿瘤出血无关的代谢改变，与基于肿瘤来源的核酸检测方法有根本不同。本研究观察到的高敏感性，包括在早期CRC中，表明基于代谢组学的特征可能为现有测试提供补充的生物学信息。然而，本研究并未设计为与FIT、CEA或其他基于血液的检测方法直接比较，这样的比较需要在适当设计的队列中进行前瞻性头对头评估。因此，五种代谢物组合最适合作为现有筛查工具的补充，而不是替代品，可能有助于提高CRC风险的分层或识别需要进一步诊断评估的个体。

我们的研究存在某些局限性，应当予以承认。首先，尽管我们的验证队列确认了发现队列的结果，但需要更大、更多样化的队列来确立这些生物标志物在不同人群和遗传背景下的普遍性。其次，尽管我们的功能分析显示这些代谢物对癌细胞迁移和侵袭有影响，但这些代谢物如何影响CRC进展的精确分子机制仍有待研究。第三，需要前瞻性研究来确定这些代谢物是否能够在临床表现之前预测CRC的发展，从而提高它们在人群筛查中的实用性。例如，这样的组合可以与现有的筛查方法结合，优先对代谢风险较高的个体进行结肠镜检查。第四，未测量的因素，如吸烟、饮酒、饮食、咖啡因摄入（影响茶碱水平）和药物，可能会影响代谢物水平，需要进一步研究。第五，关于我们的体外功能分析，我们注意到用于抑制迁移的茶碱浓度（450 μg/mL）超过了标准治疗血清浓度（10-20 μg/mL）。虽然选择这种高浓度是为了在短期分析中清楚地描绘潜在的表型效应，但这种特定代谢物的体内生物学相关性可能源于它作为全身性代谢状态（如CYP1A2活性或微生物群功能）的生物标志物，而不是在生理水平上的直接肿瘤抑制剂。未来的研究应关注调节茶碱可用性的上游代谢途径。最后，发现队列中CRC患者与健康对照组之间的年龄不平衡也是一个限制因素。尽管多变量调整和亚组分析表明四种代谢物仍然是CRC的独立预测因素，但未来需要使用年龄匹配的队列来进行研究，以完全消除潜在的混杂效应。

年龄是影响全身性代谢特征的一个重要因素，在结直肠癌的生物标志物发现中尤为关键，特别是考虑到老年人群中CRC的发病率较高。我们认识到队列之间的年龄差异是一个常见的挑战，因为在病例对照研究中，健康志愿者通常比癌症患者年轻，这可能导致混杂。然而，有几条证据支持我们组合的疾病特异性。首先，多变量调整证实2-哌啶酮、茶碱、dl-诺莱辛和亚油酸的区分能力与年龄无关。其次，即使在早期阶段（I-II期）的疾病中，这些代谢物也显著下调。由于早期患者通常没有与晚期衰老或恶病质相关的肌肉减少或严重的代谢虚弱，这种减少不太可能是衰老的副产品。最后，三种成分（2-哌啶酮、dl-诺莱辛和亚油酸）是肠道微生物群的已知产物。它们的减少与已知的CRC微生物群-代谢组轴的失调相一致，提供了一个将这些生物标志物与简单的衰老标志物区分开来的独特生物学机制。

在这项研究中，CRC患者比健康对照组年龄更大，反映了现实世界的疾病流行病学，而不仅仅是年龄匹配的实验设计。虽然这种不平衡可能引入潜在的混杂效应，但几个观察结果支持了所鉴定代谢物的疾病相关性。首先，五种代谢物中的四种在CRC患者中随年龄层级的下降是一致的，分层分析中没有观察到显著的年龄依赖性变化。其次，这些代谢物在早期CRC中仍显著改变，仅凭年龄相关的代谢下降不足以解释观察到的差异。第三，结合具有不同生物化学来源的多种代谢物可以减少对任何单一年龄敏感标志物的依赖。尽管如此，我们认识到未来的研究需要结合年龄匹配的队列和多变量建模，以便完全区分年龄和疾病特异性代谢效应。因此，当前的结果应被解释为定义了一个与CRC相关的代谢特征，而不仅仅是一个与年龄无关的筛查工具。

4. 结论

本研究提出了一种新的多平台代谢组学工作流程，通过结合无目标和目标代谢组学方法以及基于随机森林算法的特征选择，我们鉴定出五种代谢物（N-甲基胞嘧啶、2-哌啶酮、茶碱、诺莱辛和亚油酸），这些代谢物在CRC患者中的浓度一致低于健康个体，无论是在发现队列还是验证队列中都是如此。此外，整合这五种代谢物的多标志物组合表现出稳健的诊断性能，具有高准确性、敏感性和特异性，优于单独的代谢物。这一组合在早期CRC检测方面具有特别的前景，满足了非侵入性筛查替代结肠镜检查的临床需求。

使用基于细胞的表型验证表明，这些代谢物可以抑制CRC细胞系的迁移和侵袭，这表明它们虽然作为强大的诊断生物标志物，但可能反映了全身性的宿主-微生物群相互作用以及与CRC相关的肝脏清除功能改变，而不仅仅是作为肿瘤内在的驱动因素。我们鉴定出的三种细菌衍生的代谢物（2-哌啶酮、诺莱辛和亚油酸）突显了肠道微生物群失调与CRC发病机制之间的关键交叉点。这一微生物群-代谢组轴代表了CRC生物学的一个重要方面，值得进一步研究，无论是用于生物标志物的开发还是治疗靶向。除了诊断相关性外，这些鉴定的代谢物在癌细胞表型分析中也表现出可测量的生物学活性，支持了它们与CRC相关代谢状态的相关性。这些发现表明，这五种代谢物组合反映了与肿瘤行为相关的整体代谢环境，而不仅仅是作为癌症进展的直接机械驱动因素。

我们的分析方法展示了整合先进分析技术与计算方法在生物标志物发现中的价值。高分辨率质谱、基于机器学习的特征选择和功能验证的结合提供了一个全面的框架，可以应用于各种癌症类型和其他疾病的生物标志物研究。未来的研究应关注在更大、更多样化的患者群体中验证这些生物标志物，评估它们在前瞻性筛查环境中的性能，并探索肠道微生物群组成、代谢物产生和CRC发展之间的关系。在这种背景下，五种代谢物组合可能最适合作为风险分层或辅助筛查工具，特别是用于识别需要进一步诊断评估的个体。这些努力可能会带来改进的早期检测方法和潜在的结直肠癌预防策略。

总之，本研究鉴定出一种五代谢物的血浆特征，可以区分CRC患者和健康个体，并在不同疾病阶段表现出稳健的性能。**额外提示：**
- 本文介绍了一种结合宿主与微生物组特征的综合标志物，用于检测与结直肠癌（CRC）相关的系统性代谢变化，补充现有的筛查方法（如粪便潜血试验和血清生物标志物）。
- 血浆代谢组学提供的生物学信息独立于肿瘤出血或肿瘤来源的核酸，有助于改进CRC的风险分层和早期检测策略。
- 未来需要直接比较基于代谢物的检测组和现有筛查工具的前瞻性研究，以明确其最佳临床应用。

**材料与方法**
**5.1 样本收集**
血浆样本来自两个独立队列：发现队列包含来自国立成坤大学医院（NCKUH）人类生物信息库的CRC患者（N = 172）和健康志愿者（N = 115）；验证队列包含来自E-Da医院医学研究部的CRC患者（N = 47）和NCKUH的健康志愿者（N = 47）。所有参与者均签署书面知情同意书，研究方案已获NCKUH和E-Da医院机构审查委员会批准（批准编号B-ER-113-154）。排除标准包括既往癌症史、活动性感染、代谢紊乱（如糖尿病）或近期使用抗生素（采样前<4周）。
血液样本采集于乙二胺四乙酸（EDTA）管中，在4°C下以1600 × g离心10分钟以分离血浆。血浆分装至聚丙烯冻存管中（每管500 μL），并在-80°C下储存直至分析，期间不进行冻融循环。准备了一份混合参考血浆样本用于质量控制。所有CRC患者的临床数据（包括年龄、性别、TNM分期系统下的癌症阶段和原发肿瘤部位）均被系统记录。

**5.2 LC–MS/MS 分析**
代谢组学分析采用标准化流程：
- 将100 μL血浆在冰上解冻，加入30 μL内标混合物（含l-苯丙氨酸-3,3-d2（30 nmol/mL；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）、胆汁酸-2,2,4,4-d4（2 nmol/mL；Sigma-Aldrich）和溶血磷脂酰胆碱19:0（lyso PC19:0，2 nmol/mL；Sigma-Aldrich）以利于归一化和定量。
- 加入520 μL HPLC级甲醇后剧烈涡旋（3分钟）、冰上孵育（10分钟）和高速离心（15,000 × g，10分钟，4°C），然后转移450 μL上清液至新的微量离心管中并用真空浓缩器（SpeedVac，Thermo Scientific）浓缩至干涸。
- 干燥后的残留物用50 μL甲醇/水（3:1，v/v）复溶，涡旋混合（3分钟）、冰上孵育（10分钟）和再次离心（15,000 × g，10分钟，4°C）以去除不溶性物质。最终上清液（45 μL）转移至预标记的自动进样管中用于LC–MS/MS分析。
- 使用Vanquish超高效液相色谱（UHPLC）系统与Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪（均来自Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行代谢组学分析。色谱分离采用Acclaim VANQUISH C18 UHPLC柱（2.1 × 150 mm，2.2 μm颗粒大小），柱温为40°C。流动相为0.1%甲酸水混合物（A）和0.1%甲酸乙腈混合物（B）。梯度洗脱程序为：1% B（0–2分钟），从1%升至20% B（2–5分钟），从20%升至95% B（5–35分钟），在95% B保持等效洗脱（35–36分钟），然后回到1% B条件（36–36.1分钟），最后重新平衡（36.1–45分钟）。流速为0.35 mL/min，进样体积为10 μL。

**5.3 质谱数据分析**
数据采集采用正电喷雾电离模式，参数如下：喷雾电压3.5 kV，毛细管温度250°C，鞘气流量46任意单位，辅助气体流量11任意单位，喷雾气体流量2任意单位。全谱MS扫描范围为80–1200 m/z，分辨率为70,000（m/z 200处）。对每个全谱MS扫描中强度最高的10个前体离子进行MS2谱分析，采用高能碰撞解离（HCD）和阶梯化归一化碰撞能量（NCEs，分别为30、40和50）。MS2谱分辨率为17,500，AGC目标为1 × 10^5，最大注射时间为100 ms。

**5.4 基于机器学习的特征优先级评估和模型构建**
为在高维数据集中区分CRC患者与健康对照组并最小化过拟合，我们采用了两阶段机器学习框架：首先使用随机森林（RF）进行特征排序，而不作为最终预测模型。RF因其对多重共线性、非线性特征相互作用和未靶向代谢组数据中常见噪声的鲁棒性而被选择。初始数据集包含146,880个MS1特征。为提高计算效率和减少单次特征选择带来的偏差，将特征空间随机划分为十个不重叠的子集，每个子集分别用RF分类器进行分析。每个子集内样本分为训练集（70%）和内部测试集（30%）。RF模型采用20棵决策树进行训练，以获得稳定的特征重要性排名并避免模型复杂度（图S1）。通过Gini杂质均值下降量对特征进行排序，将具有跨子集一致信息量的特征聚合，得到1007个候选区分特征。需要注意的是，RF衍生的特征并未直接用作诊断工具，后续分析侧重于生物学解释力和临床相关性。进一步使用接收者操作特征（ROC）分析筛选特征，AUC值大于0.90的特征被优先用于代谢物注释。仅保留识别得分至少为80%的特征。

**5.5 年龄和人口统计效应的评估**
为评估年龄和性别不平衡对CRC患者和健康对照组的影响，我们采用多元逻辑回归（包含年龄和性别作为协变量）和按年龄、性别及肿瘤位置分层的分组统计分析（p < 0.05）。

**5.6 细胞增殖实验**
评估所鉴定CRC相关代谢物是否具有与癌细胞行为相关的生物学活性，我们进行了系列体外表型实验，重点观察细胞增殖和运动能力。细胞活力和增殖通过Cell Counting Kit-8（CCK-8；Enzo Life Sciences，美国纽约）进行测定。人类CRC细胞系HCT116和T5088分别培养在McCoy’s 5 A培养基（Gibco Life Technologies，美国）和DMEM/F-12培养基（Invitrogen，美国）中，培养基均添加10%胎牛血清（FBS，GIBCO，美国）和1%青霉素-链霉素（GIBCO，美国）。细胞在含5% CO2的湿润环境中于37°C培养。细胞以每孔5 × 10^3个细胞的密度接种在96孔平底微孔板中，并使其过夜附着。候选代谢物溶解在适当溶剂中并稀释至最终浓度（0.1–100 μM），每次实验前新鲜配制处理溶液。处理24小时后，向每个孔加入10 μL CCK-8溶液并继续培养2小时。通过微孔板光度计（U2800A，日本东京）在450 nm处测量吸光度。增殖率按以下公式计算：
**增殖率（%）= [(处理后细胞吸光度 – 对照细胞吸光度) / (空白细胞吸光度 – 空白吸光度)] × 100**。所有实验均重复三次。

**5.7 Transwell细胞迁移实验**
使用含有8 μm孔径的聚碳酸酯膜的Transwell透膜装置评估细胞迁移能力。实验前将细胞饥饿12小时以减少增殖依赖性影响。细胞悬浮在含有候选代谢物的无血清培养基中（N-甲基胞苷：8 ng/mL；2-哌啶酮：4 μg/mL；茶碱：450 μg/mL；dl-诺尔莱辛酸：220 μg/mL），接种密度为每孔5 × 10^4个细胞。下腔含500 μL完全培养基并添加10% FBS作为趋化因子。在37°C、5% CO2条件下培养18小时后，用棉签清除膜上表面的非迁移细胞。粘附在膜下的迁移细胞用100%甲醇在室温下固定30分钟，然后用1%结晶紫溶液染色1小时。通过ImageJ软件（NIH版本4.1a）分析每孔5个随机视野的迁移细胞数量。

**5.8 伤口愈合实验**
使用Corning公司生产的带有8 μm孔径的多孔膜Transwell装置评估细胞迁移能力。细胞在实验前饥饿12小时以消除增殖依赖性影响。将候选代谢物加入无血清培养基中，然后接种在含有上述浓度的细胞中。培养24小时后，用光显微镜拍摄相位对比图像，观察伤口愈合过程。伤口区域的面积通过ImageJ软件进行测量，伤口闭合的百分比通过以下公式计算：迁移面积（%）= [(0小时时的面积 – 24小时时的面积) / 0小时时的面积] × 100。所有实验均重复三次，并各自独立进行三次。