利用三野冢反应（Mitsunobu Reaction）合成桦木素（Betulin）的C-30醚类、酯类和胺类化合物的新方法及其产物的生物学评价

《ACS Omega》：New Synthetic Approach to C-30 Ethers, Esters, and Amines of Betulin Using the Mitsunobu Reaction and Biological Evaluation of the Products

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从市售的 BETULIN 二醋酸酯出发，开发了一种新的三步合成方法，用于修饰 BETULIN 的 C-30 位置。该方法的范围显著超过了以往使用的方法，并且产率更高。最终的 Mitsunobu 反应是合成的关键步骤，经过优化后，合成了 39 种新的衍生物——醚类、酯类和胺类，产率良好到较高。所有这些新型化合物都经过了体外细胞毒性测试，针对六种癌细胞系和两种非癌细胞系进行了测试。化合物 30 和 37 对 CCRF-CEM 癌细胞表现出很强的细胞毒性（IC50 约为 5 μM）。此外，化合物 37 在多种癌细胞系中都显示出广泛的活性，表明其具有潜在的多靶点抗癌活性。这两种化合物都能抑制 DNA 和 RNA 的合成，其中化合物 37 在高剂量下能强烈抑制转录。凋亡诱导分析显示，两种化合物的机制有所不同：化合物 30 促进了强烈的凋亡，而化合物 37 则似乎通过其他细胞死亡途径起作用。生物合成途径的改进成为一种有前景的抗癌策略，化合物 37 是其中最值得关注的候选物。

### 引言
根据 2024 年发布的数据，自然界中存在相当比例的化合物符合临床试验和药品监管批准的标准。(1) 还有研究表明，与合成化合物相比，天然产物及其衍生物在医学研究中是更可行的选择，因为它们的毒性较低。(1) 这些发现为天然产物及其衍生物作为潜在的新药物提供了有力的支持。在当前的研究活动中，五环三萜类化合物 BETULIN 吸引了包括我们研究小组在内的许多科学家的关注。其中一个主要原因是它在自然资源中的丰富储量。BETULIN 常见于白桦树皮中，并且可以大量分离出来。(2?4) 另一个重要因素是 BETULIN 衍生物具有广泛的生物活性，包括抗癌效果（2015 年有详细综述)，(5) 以及它们的抗病毒(6) 和抗炎(7)潜力，这些特性在多发性硬化症的治疗中可能具有应用价值。(8) 尽管 BETULIN 及其衍生物种类繁多且具有多种有趣的生物活性，但在进行进一步开发之前仍存在一些重大挑战，例如需要增强其生物活性以及其低水溶性（根据 J?ger 等人的研究，水溶性仅为 0.08 μg/mL)。(9) 为了解决这些问题，人们对 BETULIN 的化学结构进行了多种改伐，从而优化了其原本不理想的性质。BETULIN 结构中有多个位置可以进行化学修饰，过去对此进行了大量研究，例如 C-3 位置和 C-28 位置。(10?19) 在 BETULIN 结构中，C-30 位置的烯丙基位点是一个较少被研究的化学修饰位点。大多数针对 C-30 位置的合成工作是通过 NBS/CCl4 方法引入溴原子来实现的，随后用各种亲核试剂进行取代，如羧酸盐、(21,22) 胺类、(27,28) 腈、(24,26,30,31) 吡啶和其他含氮杂环、(25) 硫醚、(33,34) 硝酸银、(32) 和亚磷酸盐。(35) 对这些改伐后的化合物进行生物活性测试后发现，某些改伐显著增强了抗癌活性，这激发了我们进一步研究这类化合物的兴趣，这也是我们当前研究的目标之一。具体来说，Chrobak 等人发表的一项综合性研究了利用酯官能团对 BETULIN 进行修饰的方法。(36) 筛选结果显示，这些化合物对癌细胞的细胞毒性有所增强，IC50 值介于 1.24 至 6.03 μM 之间。

受先前研究的启发，并鉴于在 BETULIN 的 C-30 位置进行修饰方面的进展有限，我们希望在这一领域取得进展。特别是，我们旨在建立一种新的、更可靠的方法，以取代基于 NBS/CCl4 协议的标准方法。由于环境和监管方面的考虑，四氯化碳正逐渐被淘汰。(37) 而且传统方法通常产率较低。在这项工作中，我们描述了在 C-30 位置引入 OH 基团的优化条件，然后通过 Mitsunobu 协议用氧或氮基偶联剂进行取代。这种反应具有多样性、高产率，并且可以在温和条件下进行，这对于天然产物尤其有利。(38) 我们制备了 39 种新的化合物并测试了它们的细胞毒性。在这 39 种新化合物中，有 7 种是酯类，它们与参考文献(36)中的化合物类似，只是取代基不同。

### 结果与讨论
#### 化学
我们提出的三步序列从市售的 BETULIN 二醋酸酯开始。首先，选择性地氧化 BETULIN 二醋酸酯的烯丙基位置（图 1）。与之前描述的条件(39?41)不同，这些条件需要大量的二氧化硒，我们使用了催化系统（SeO2/TBHP）。这不仅将产率从之前的 56%（使用原始方法）(39) 提高到了 84%，还避免了大量形成难以从最终产品中完全去除的胶体态硒。第二步是在 Luche 条件下选择性还原醛类(1)（图 1）。

**图 1. 使用烯丙基氧化/还原序列修改 BETULIN 二醋酸酯的 C-30 位置**

**试剂和条件：**
(a) SeO2, TBHP, DCM, AcOH, 室温, 48 小时, 84%；
(b) NaBH4, CeCl3·7H2O, THF, MeOH, 15 分钟, 78%。

如表 1 所总结的，我们的方法提供了与传统方法的竞争性替代方案。与广泛使用的 NBS/CCl4 方法不同，后者使用有毒的四氯化碳且产率不稳定，我们的两步方法达到了相当的平均效率，且不需要有毒的 CCl4。此外，我们的方案在总产率方面优于现有的两步方法。

**表 1. 在 BETULIN 二醋酸酯的 C-30 位置引入离去基团（溴或羟基）的合成策略比较**
| 合成策略 | 步骤数量 | 总产率 (%) |
|------|--------|-------|
| NBS/CCl4 (20?32) | 15 | 1–73 | 66 (平均) |
| 氧化/水解序列 (36,42) | 2 | 54 | 3 |
| 本工作 | 2 | 6 | 6 |

第三步是使衍生物 2 与合适的偶联剂在 ADDM/PBu3 存在下进行偶联反应。选择这种 Mitsunobu 试剂是因为其高效性、多功能性和方便的操作及纯化程序，适用于三萜类化学研究。(43) 在偶联剂的选择上，我们首先关注了与 Mitsunobu 反应中常用的酚类化合物的反应。(38) 我们感兴趣的是 C-30 位置上的烷氧基芳基醚结构对生物活性的影响，这一兴趣源于它们与已知活性酯类的相似性（两者都是氢键受体(44)）。其次，本工作中提出的醚类衍生物在文献中尚未有报道。为了评估反应的范围并扩大可用于生物筛选的化合物集合，我们制备了 26 种新的醚类衍生物(3–28)，其中包含在邻位、间位和对位上带有多种给电子和吸电子官能团的化合物（图 2）。反应时间因衍生物的不同而异，有些需要 1 小时，有些需要 24 小时，具体信息在实验部分有说明。该反应对富电子和缺电子系统都具有很高的容忍度，尽管在电子中性或略富电子的环状结构中产率通常更高。通过制备一个保护的氨基酸 28，也证明了反应的范围。除了吡啶衍生物 27 外，所有化合物(3–28)的产率都很高。此外，这种方法会产生含有其他吡啶异构体的复杂混合物。这可能是由于吡啶醇与吡啶酮形式的互变异构所致。另一方面，化合物 29 是一个成功的例子，它使用了 BOC 保护的氨基酸，并通过选择性去保护无需考虑乙酰基的存在。

**图 2. 通过 Mitsunobu 协议制备的三萜类 C-30 酯类**

**试剂和条件：**
(a) R1OH, ADDM, PBu3, THF, 室温, 1 至 24 小时；
(b) TFA, DCM, 室温, 30 分钟, 68%。

酯类衍生物(31–37)的制备方法与醚类类似（图 3）。通过使用少量选定的芳香族、脂肪族和杂环羧酸来测试了反应的范围。由于已有许多文献记载了类似化合物的备用合成方法，因此我们有意限制了这类化合物的反应范围。这些例子证明了我们的方案也适用于通常通过 DCC 协议制备的衍生物。(36) 使用了与参考文献(36)不同的取代基。反应时间因衍生物的不同而异，有些需要 1 小时，有些需要 24 小时，具体信息在实验部分有说明。在所有情况下，该方案都能获得良好到较高的产率，除了含有吸电子硝基官能团的化合物 33。与化合物 30 类似，化合物 37 也是通过 Mitsunobu 反应和随后的 BOC 去保护得到的，显示出与这类修饰方法的良好兼容性。

**图 3. 通过 Mitsunobu 协议制备的三萜类 C-30 酯类**

为了进一步展示所开发合成途径的多样性，我们使用结构不同的氮基试剂（如邻苯二甲酰胺和磺酰胺）测试了其反应范围（图 4）。反应时间因衍生物的不同而异，有些需要 1 小时，有些需要 24 小时，具体信息在实验部分有说明。在所有测试的案例中，反应都取得了高产率，这证明了该方案的一般适用性。此外，我们还使用标准去保护条件对化合物 40 进行了脱氮反应，以证明我们的合成途径可用于 BETULIN 的仲胺合成。

#### 生物学
**细胞毒性**
本研究中的化合物对多种人类癌细胞系（CCRF-CEM、HCT116、HCT116 p53–/–、K562、A549 和 U2OS）和非癌细胞系（BJ 和 MRC-5）的细胞毒性进行了评估（表 2）。IC50 值高于 50 μM 的化合物被认为无活性，因此未纳入表 2。数据显示，大多数化合物在所有细胞系中都表现出高微摩尔浓度的活性。尽管总体活性较低，但某些化合物在选定的癌细胞系中表现出中等程度的细胞毒性。化合物 2 对 CCRF-CEM 显示出中等细胞毒性（IC50 = 16.68 μM），在 HCT116（34.96 μM）、HCT116 p53–/–（39.94 μM）和 K562（39.98 μM）细胞系中的活性较弱。此外，化合物 27 对 CCRF-CEM 显示出选择性细胞毒性（IC50 = 16.90 μM），而在其他细胞系中无活性。在测试的化合物中，化合物 30 和 37 是最活跃的分子。本研究中发现的最佳化合物是 37，它对 CCRF-CEM 细胞显示出显著的细胞毒性（IC50 = 5.65 μM），对 HCT116（12.30 μM）、HCT116 p53–/–（8.40 μM）、K562（6.65 μM）和 U2OS（5.45 μM）细胞系也表现出中等活性，而在健康细胞系中的活性较低（BJ，IC50 = 26.42 μM 和 MRC-5，IC50 = 25.00 μM），显示出相对于 BJ 和 MRC-5 细胞较高的选择性指数（SI）。化合物 37 在多种癌细胞系中表现出一致的细胞毒性，表明其作用机制可能较为广泛。化合物 30 在 CCRF-CEM 细胞中表现出显著细胞毒性（IC50 = 9.61 μM），在 HCT116（31.02 μM）、HCT116 p53–/–（30.37 μM）和 K562（23.24 μM）中表现出中等活性，而对非癌细胞系无显著活性（IC50 > 50 μM），这表明其选择性优于化合物 37。总结来说，尽管大多数测试化合物的活性处于中等或较低水平，但将衍生物30和37鉴定为高活性候选物，特别是对CCRF-CEM细胞，是一个有价值的发现。此外，化合物2和27的中等活性表明，即使是微小的结构修饰也可能释放出选择性的细胞毒性潜力。进一步的研究，包括选择性指数评估和作用机制分析，对于充分表征这些化合物及其治疗潜力至关重要。

表2. 选定化合物对六种癌细胞系（CCRF-CEM、HCT116、HCT116 p53–/–、K562、A549和U2OS）以及两种非癌细胞系（BJ、MRC-5）的细胞毒性（IC50，μmol/L）

为了初步了解最具潜在活性的衍生物的药代动力学行为，我们使用SwissADME网络服务器进行了计算机模拟ADME分析；结果见表S2。计算表明，最有前途的化合物2、27、30和37的溶解度较差，并且由于分子量高和亲脂性强而不符合经典的Lipinski五规则。尽管如此，如果这些分子被选为进一步开发的目标，有许多方法可以通过前体药物和添加剂在给药过程中提高它们的血浆浓度。还使用ProTox 3.0网络服务器进行了毒性分析。支持信息文件中的表S3显示，化合物2的LD50预测值最高（5000 mg/kg），化合物37的LD50次之（5000 mg/kg）。这些化合物的可能毒性靶点是胺氧化酶A（AOFA）和前列腺素G/H合成酶1（PGH1）。

为了确保所有测量的细胞终点都能被透明地解释，本研究中的流式细胞术结果以代表性直方图和点图的形式呈现。这些图形输出直接展示了多参数流式细胞术的主要读数，无需额外的条形图总结即可说明治疗引起的DNA含量、有丝分裂活性、DNA和RNA合成以及凋亡的变化。所有相关的门限、亚群和阳性阈值都在显示的图表中清晰标注，以便于直接解读。接下来，我们评估了化合物30和37如何影响CCRF-CEM白血病细胞的细胞周期进展和生物合成过程。为了深入了解它们的细胞毒性机制，我们分析了在1×和5× IC50浓度下处理24小时后，细胞周期分布、有丝分裂指数（pH3Ser10）、DNA合成（BrdU掺入）和RNA合成（BrU掺入）以及凋亡（sub-G1阶段）的变化（图1）。

图1. CCRF-CEM细胞中化合物30和37的细胞反应的多参数流式细胞术分析。(A) 细胞周期分布。代表性PI直方图显示了在1×和5× IC50浓度下处理24小时后G1、S和G2/M阶段的分布。PI荧光（x轴）用于量化总DNA含量；仅包括活的单细胞事件。未处理的细胞作为对照组。(B) 有丝分裂指数（pH3Ser10）。通过流式细胞术检测磷酸化组蛋白H-3（Ser10）阳性细胞以衡量有丝分裂活性。细胞在相同处理条件下用抗pH3Ser10抗体染色。百分比表示pH3Ser10门控群体（区域B）中的有丝分裂细胞比例。(C) DNA合成活性（BrdU掺入）。细胞在收获前被BrdU脉冲标记。BrdU阳性细胞（区域B）反映活跃的复制群体。点图显示了每种处理条件下的相对BrdU掺入量。(D) RNA合成活性（BrdU掺入）。使用与BrdU具交叉反应性的抗BrdU抗体通过流式细胞术检测BrdU标记的新生RNA。区域B表示BrdU阳性细胞。数据展示了转录活性的治疗依赖性调节。(E) 凋亡细胞死亡（sub-G1）。代表性PI直方图显示了在化合物处理24小时后具有sub-G1 DNA含量的细胞比例。sub-G1部分量化了凋亡DNA片段化。所有实验均以生物学三重复进行，结果相似。流式细胞术数据使用Kaluza软件（Beckman Coulter）进行处理和定量分析。

总体而言，这些测定提供了这些化合物如何影响与增殖和存活相关的关键细胞过程的多方面视图。有趣的是，与未处理的对照组相比，两种化合物都没有引起细胞周期分布的显著变化（图1a）。对于化合物30和37，G0/G1、S和G2/M阶段的细胞比例在测试的浓度范围内保持非常稳定。这一观察结果表明，细胞周期停滞不是这些化合物的主要作用机制。相反，它们的细胞毒性似乎来源于对关键生物合成过程的更微妙或间接的干扰。这一观点通过pH3Ser10表达的有丝分裂指数分析得到了支持（图1b）。虽然观察到轻微的波动（在1× IC50时略有增加，在5× IC50时减少），但没有一种化合物一致地增加了有丝分裂细胞的数量，进一步表明直接阻断有丝分裂进程不太可能是造成细胞毒性的原因（图1b）。从DNA合成的评估中出现了更明显的模式（图1c）。在较低浓度（1× IC50）下，30和37都刺激了DNA合成或BrdU掺入（分别为56.18%和54.95%，对比对照组49.26%）。这种短暂的增加可能反映了由初始细胞损伤触发的补偿性过度复制/复制应激或DNA修复反应。然而，在较高浓度（5× IC50）下，出现了不同的情况：30仅显示出轻微的DNA合成减少（46.61%），而37则显著抑制了DNA合成（12.35%）。这种浓度依赖的抑制与复制应激的诱导一致，这是DNA损伤信号、细胞周期检查点以及最终凋亡的已知触发因素。在RNA合成测定中也观察到了类似的模式（图1d）。在1× IC50下，两种化合物都刺激了RNA合成（分别为47.94%和41.17%，对比对照组37.32%），可能是对压力的早期适应性反应。然而，在较高浓度（5× IC50）下，两种化合物都显著抑制了RNA合成（30：26.73%；37：2.64%）。37在5× IC50下对RNA的显著抑制尤其显著，表明转录机制受到干扰，这可能会迅速危及细胞活力并触发程序性细胞死亡途径。这些发现共同指向了一种多方面的细胞毒性机制，即30和37并非通过导致明显的细胞周期停滞，而是可能干扰DNA复制和转录过程，尤其是在较高浓度下。在较低剂量下，DNA/RNA合成的初步轻微刺激可能反映了由于DNA损伤而引起的补偿性S期进入。然而，在较高剂量下，特别是37，这种动态转变为对DNA和RNA合成的强烈抑制，这与复制应激的诱导一致，复制应激是DNA损伤信号、细胞周期检查点以及最终凋亡的已知触发因素。

这些测定结果共同提供了这些化合物如何影响白血病细胞中的细胞周期动态、生物合成能力和细胞死亡途径的全面概览。总体而言，目前的数据强调了化合物37作为重要细胞途径的强大调节剂的作用，支持其作为潜在抗癌剂的进一步临床前评估的优先级。鉴于这些化合物对生物合成过程的影响，我们接下来探讨了这些干扰是否转化为程序性细胞死亡的激活，通过流式细胞术评估了sub-G1凋亡群体来衡量。在未处理的CCRF-CEM细胞中，sub-G1群体占细胞总数的5.01%，反映了基线水平的凋亡。用相当于其IC50浓度的30处理后，sub-G1群体略有增加（6.97%），表明在较低剂量下有有限的促凋亡反应。然而，在5× IC50下，sub-G1群体显著增加（27.20%），表明凋亡的诱导具有浓度依赖性。这一发现与在30较高浓度下观察到的DNA和RNA合成的轻微抑制相一致，表明虽然该化合物不会引起强烈的细胞周期停滞或有丝分裂阻断，但其对生物合成过程的干扰最终引发了凋亡细胞死亡。相比之下，37表现出不同的凋亡特征。在1× IC50下，它使sub-G1群体略有增加（6.5%），与30相当，表明早期凋亡诱导的迹象。然而，即使在5× IC50下，sub-G1群体也仅达到了10.67%，远低于30在同一浓度下的凋亡反应。这一观察结果特别有趣，因为37在较高浓度下对DNA和RNA合成的抑制更为显著。生物合成过程的强烈抑制与相对温和的凋亡诱导之间的差异表明，37可能参与了额外的非凋亡机制，如坏死、自噬或不可逆的复制应激，最终导致有丝分裂灾难。总的来说，这些发现指向了一种多方面的细胞毒性机制，即30和37不仅通过强制细胞周期停滞，还可能干扰DNA复制和转录过程，尤其是在较高浓度下。在较低剂量下，DNA/RNA合成的初步轻微刺激可能反映了由于DNA损伤而引起的非计划性复制进入S期。然而，在较高剂量下，特别是37，这种动态转变为对DNA和RNA合成的强烈抑制，这与重要生物合成途径的崩溃和细胞死亡途径的激活一致。从机制上看，这种抑制可能源于对DNA或转录机制的直接或间接干扰。值得注意的是，这些结果与针对基本生物合成过程的有效抗癌策略的概念一致，特别是在像CCRF-CEM这样的快速增殖的白血病细胞中。总之，目前的数据突出了37作为一个强大的调节剂的作用，支持其作为潜在抗癌剂的进一步临床前评估的优先级。鉴于这些化合物对生物合成过程的影响，我们接下来探讨了这些干扰是否转化为程序性细胞死亡的激活，通过流式细胞术评估了sub-G1凋亡群体。在未经处理的CCRF-CEM细胞中，sub-G1群体占5.01%，反映了基线水平的凋亡。用相当于其IC50浓度的30处理后，sub-G1群体略有增加（6.97%），表明在较低剂量下有有限的促凋亡反应。然而，在5× IC50下，sub-G1群体显著增加（27.20%），表明凋亡的诱导具有浓度依赖性。这一发现与在30较高浓度下观察到的DNA和RNA合成的轻微抑制完全一致，表明虽然该化合物不会引起强烈的细胞周期停滞或有丝分裂阻断，但其对生物合成过程的干扰最终引发了凋亡细胞死亡。相比之下，37表现出不同的凋亡特征。在1× IC50下，它使sub-G1群体略有增加（6.5%），与30相当，表明早期凋亡诱导的迹象。然而，即使在5× IC50下，sub-G1群体也仅达到10.67%，远低于30在同一浓度下的凋亡反应。这一观察结果特别有趣，因为37在较高浓度下对DNA和RNA合成的抑制更为显著。生物合成过程的强烈抑制与相对温和的凋亡诱导之间的差异表明，37可能参与了额外的非凋亡机制，如坏死、自噬或不可逆的复制应激，最终导致有丝分裂灾难。或者，测量的时间可能捕捉到了细胞死亡发生前的早期阶段。总的来说，这些数据强调了生物合成干扰与凋亡诱导之间的复杂相互作用。虽然两种化合物都干扰DNA和RNA合成，尤其是在较高浓度下，但只有30引起了强烈的凋亡，如sub-G1积累所反映的。这种极性强调了整合多个分析终点以全面定义新型抗癌剂的细胞毒性机制的重要性。

本研究的主要目标是找到一种优化的合成序列，用于在木犀草素的C-30位置进行衍生化，并扩展已知的半合成衍生物库。我们的新合成途径产生了各种三萜醚、酯、邻苯二甲酰亚胺和磺胺类药物。合成过程分为三个步骤：首先是优化的烯丙基氧化，接着是羰基的选择性还原，最后是Mitsunobu取代。这种合成策略生成了多种新型化合物，产率从良好到很高，并为未来多化合物库的合成提供了许多选择。对一组癌细胞和健康细胞的细胞毒性活性的基本筛选显示，化合物37的活性最高（在CCRF-CEM中的IC50值为5.65，在U2OS中为5.45 μM）。这项研究表明，在这个结构多样的化合物库中，只有少数化合物表现出显著的细胞毒性，突显了结构精细调节以实现强效抗癌活性的重要性。值得注意的是，30和37作为最有前途的候选物脱颖而出，对CCRF-CEM白血病细胞表现出明显的活性，并且在其他癌细胞系中也表现出更广泛的细胞毒性谱型。尽管化合物30和37的生物药学性质预测不佳，但它们作为先导骨架具有潜力。未来的结构优化将集中在降低亲脂性和探索其他策略（例如基于脂质的载体）以提高这些疏水候选物的溶性和吸收性。机制研究揭示，这些化合物的细胞毒性主要不是通过经典的细胞周期停滞或有丝分裂阻断来介导的，而是通过对关键生物合成过程的深刻干扰，特别是DNA和RNA合成。37对DNA和RNA合成的显著浓度依赖性抑制，加上其轻微的凋亡诱导，表明了一种复杂的机制，涉及复制应激和潜在的替代细胞死亡途径的参与。相反，30在较高浓度下表现出强烈的凋亡作用，表明生物合成抑制与程序性细胞死亡之间存在更直接的联系。这些发现强调了针对生物合成机制作为抗癌策略的治疗潜力，并特别将37作为进一步临床前开发的强大候选物。该研究进一步强调了整合细胞毒性、细胞周期和凋亡分析在揭示新型抗癌化合物多方面机制中的重要性，为未来的机制研究和体内研究提供了有力的依据。

实验部分
化学
一般信息
所有试剂均为试剂级，无需进一步纯化即可使用。起始物β-丁二酸二醋酯的纯度为98%，购自Betulinines公司（www.betulinines.com）。其他所有化学品和溶剂（包括干燥剂）均购自默克公司（德国）。反应过程通过Kieselgel 60 F254板（默克，德国）上的TLC进行监测，并使用紫外光（254 nm）进行检测，随后通过10%水溶液H2SO4处理并加热至150–200 °C进行显色。纯化过程使用Silica gel 60 Merck 7734柱色谱法完成（默克，德国）。所有1H和13C NMR实验分别在CDCl3溶液中，以500 MHz（JEOL JNM-ECX-500）或400 MHz（JEOL JNM-ECA400II）进行，1H NMR的采样频率为25 MHz，13C NMR的采样频率为126 MHz或100 MHz。化学位移δ以残余溶剂峰为参考（对于CDCl3，δH = 7.26 ppm，δC = 77.16 ppm）。化学位移δ以百万分之一（ppm）表示，偶联常数J以赫兹（Hz）表示。HRMS分析使用SELECT SERIES Cyclic IMS QTOF仪器（Waters Corp., Wilmslow, 英国）进行，该仪器配备有Atmospheric Solid Analysis Probe（ASAP）源，并采用正模式操作。质量校准使用碘化钠2 μg/μL在丙-2-醇/水（1:1, v/v）溶液中进行（m/z 50–2000）。仪器参数设置为：电晕电流2 μA，标准条件下的脱溶温度为400 °C，对于离子化效率较低的化合物，脱溶温度为500 °C。数据采集时使用浓度为50 pg/μL的亮氨酸脑啡肽进行锁相校正，溶剂为含0.1%甲酸的水/乙腈（1:1, v/v）混合物，监测[M + H]+离子在m/z 556.2771处的信号。样品溶解在丙酮中，分析浓度为10 μg/mL，对于离子化效率较低的化合物，分析浓度提高到50 μg/mL。对于ASAP引入方法，将石英毛细管直接浸入样品溶液中，然后将其放置在ASAP源中进行分析。

红外光谱（IR）样品使用Nicolet iS50 FTIR光谱仪（Thermo Fisher Scientific）在衰减全反射（ATR）模式下进行分析。

3β,28-二醋氧-30-氧基卢普-20(29)-烯的合成
- β-丁二酸二醋酯（98%，10.2 g，0.019 mol）溶解在DCM（132 mL）和AcOH（78 mL）的混合物中。然后向反应混合物中加入70%叔丁基过氧化氢水溶液（7.8 mL，0.057 mol）和二氧化硒（632 mg，0.0057 mol）。反应混合物在室温下搅拌48 h。通过使用己烷/EtOAc（4:1）作为流动相的TLC分析确认反应完成。反应混合物用DCM（200 mL）稀释。有机相用1 M FeSO4·7H2O溶液（250 mL）洗涤三次，用饱和NaHCO3溶液（250 mL）洗涤两次，再用盐水（200 mL）洗涤一次。有机相用无水MgSO4干燥，随后在减压条件下使用旋转蒸发器去除有机溶剂，然后通过SiO2柱色谱法纯化，流动相梯度为己烷/EtOAc（7:1至4:1）。纯化后，醛1以84%的产率得到白色固体。
1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 9.50 (s, 1H, CHO), 6.27 (s, 1H, H-29), 5.92 (s, 1H, H-29), 4.47 – 4.42 (m, 1H, H-3), 4.27 (d, J = 11.2 Hz, 1H, H-28), 3.86 (d, J = 11.1 Hz, 1H, H-28), 2.89 – 2.69 (m, 1H, H-19), 2.06 (s, 3H, CH3C═O), 2.03 (s, 3H, CH3C═O), 1.01 (s, 3H, CH3), 0.93 (s, 3H, CH3), 0.84 – 0.81 (m, 9H, 3 × CH3)。
13C NMR（126 MHz，CDCl3）：δ 194.83, 171.59, 171.14, 156.70, 133.37, 81.02, 62.56, 55.50, 50.22, 46.72, 42.71, 40.97, 38.51, 37.92, 37.37, 37.29, 37.17, 34.62, 34.25, 32.16, 29.87, 28.07, 27.59, 27.11, 23.80, 21.44, 21.16, 20.93, 18.28, 16.62, 16.24, 16.13, 14.73, 14.34。
IR（DRIFT）：2938.56, 2868.40, 1736.71, 1722.09, 1687.35, 1460.32, 1389.86, 1365.05, 1235.03, 1028.61, 1014.09。

3β,28-二酰氧-30-羟基卢普-20(29)-烯的合成
- 醛1（6.44 g，0.012 mol）和CeCl3·7H2O（8 g，0.0216 mol）溶解在THF（120 mL）和MeOH（40 mL）的混合物中。然后分次向反应混合物中加入硼氢化钠（817 mg，0.0216 mol）。在完全加入硼氢化钠后，反应混合物在室温下搅拌15 min。通过使用己烷/EtOAc（3:1）作为流动相的TLC分析确认反应完成。向反应混合物中加入稀释的EtOAc（180 mL）和1 M HCl溶液（90 mL）。分相后，用水（90 mL）再萃取一次水层，然后用盐水（90 mL）萃取一次。有机相用无水MgSO4干燥，随后在减压条件下使用旋转蒸发器去除有机溶剂，然后通过SiO2柱色谱法纯化，流动相梯度为己烷/EtOAc（4:1至2:1）。纯化后，羟基衍生物2以78%的产率得到白色固体。
1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 4.96 (d, J = 1.1 Hz, 1H, H-29), 4.90 (s, 1H, H-29), 4.48 – 4.44 (m, 1H, H-3), 4.23 (dd, J = 11.2, 1.4 Hz, 1H, H-28), 4.15 – 4.07 (m, 2H, H-30), 3.84 (d, J = 11.0 Hz, 1H, H-28), 2.34 (td, J = 11.0, 5.5 Hz, 1H, H-19), 2.06 (s, 3H, CH3C═O), 2.03 (s, 3H, CH3C═O), 1.03 (s, 3H, CH3), 0.97 (s, 3H, CH3), 0.85 – 0.83 (m, 6H, 2 × CH3), 0.83 (s, 3H)。
13C NMR（126 MHz，CDCl3）：δ 171.71, 171.13, 154.36, 107.43, 65.13, 62.62, 55.52, 50.40, 49.61, 46.48, 43.59, 42.81, 41.07, 38.53, 37.95, 37.65, 37.21, 34.53, 34.30, 31.70, 29.90, 28.09, 27.19, 26.84, 23.83, 21.45, 21.16, 21.05, 18.31, 16.63, 16.30, 16.19, 14.87。
IR（DRIFT）：3552.05, 2939.03, 2870.45, 1731.97, 1712.75, 1456.62, 1363.27, 1242.00, 1030.27, 1013.20。

Mitsunobu反应的一般程序
Mitsunobu反应在惰性条件下进行。将醇2（326 mg，0.6 mmol）、三丁基膦（600 μL，2.4 mmol）和预 nucleophile（2.4 mmol）溶解在无水THF（12 mL）中。然后向反应混合物中加入偶氮二羧酸双吗啉酯（ADDM，615 mg，2.4 mmol）。反应混合物在室温下搅拌1或24 h（取决于预 nucleophile）。通过使用己烷/EtOAc（3:1）作为流动相的TLC分析确认反应完成。反应混合物用乙醚（50 mL）稀释。有机相用水（20 mL）洗涤一次，用1 M NaOH溶液（20 mL）洗涤三次，再用盐水（20 mL）洗涤一次。有机相用无水MgSO4干燥，随后在减压条件下使用旋转蒸发器去除有机溶剂，然后通过SiO2柱色谱法纯化（具体条件根据每种衍生物的不同而有所差异）。

醚类化合物3–29的合成
- 3β,28-二酰氧-30-苯氧基卢普-20(29)-烯（3）
化合物3按Mitsunobu反应的一般程序制备。反应时间为1 h。通过使用己烷/EtOAc（8:1）的柱色谱法纯化后，衍生物3以70%的产率得到白色固体。
1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 7.31 – 7.27 (m, 2H, aryl), 6.97 – 6.91 (m, 3H, aryl), 5.09 (d, J = 1.1 Hz, 1H, H-29), 5.02 (s, 1H, H-29), 4.49 – 4.45 (m, 3H, H-3, H-30), 4.26 (dd, J = 11.2, 1.1 Hz, 1H, H-28), 3.85 (d, J = 11.0 Hz, 1H, H-28), 2.44 (td, J = 11.3, 5.5 Hz, 1H, H-19), 2.07 (s, 3H, CH3C═O), 2.04 (s, 3H, CH3C═O), 1.04 (s, 3H, CH3), 0.97 (s, 3H, CH3), 0.85 (s, 3H, CH3), 0.85 (s, 3H, CH3)。
13C NMR（126 MHz，CDCl3）：δ 171.72, 171.14, 158.98, 149.87, 129.57, 120.95, 114.84, 110.68, 81.06, 70.36, 62.68, 55.54, 50.43, 49.65, 46.50, 43.68, 42.85, 41.10, 38.55, 37.96, 37.70, 37.23, 34.53, 34.33, 31.55, 29.94, 29.85, 28.10, 27.21, 26.91, 23.85, 21.46, 21.18, 21.09, 18.32, 16.64, 16.32, 16.22, 14.93。
IR（DRIFT）：2936.17, 2866.35, 1731.66, 1598.77, 1241.33, 1029.74。

- 3β,28-二酰氧-30-(4-甲基苯氧基)卢普-20(29)-烯（4）
化合物4按Mitsunobu反应的一般程序制备。反应时间为1 h。通过使用己烷/EtOAc（6:1）的柱色谱法纯化后，衍生物4以90%的产率得到白色固体。
1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 7.09 – 7.06 (m, 2H, aryl), 6.83 – 6.80 (m, 2H, aryl), 5.07 (d, J = 1.1 Hz, 1H, H-29), 5.00 (s, 1H, H-29), 4.49 – 4.44 (m, 3H, H-3, H-30), 4.26 (dd, J = 11.1, 1.0 Hz, 1H, H-28), 3.85 (d, J = 11.0 Hz, 1H, H-28), 2.43 (td, J = 11.2, 5.3 Hz, 1H, H-19), 2.29 (s, 3H, benzylic), 2.07 (s, 3H, CH3C═O), 2.04 (s, 3H, CH3C═O), 1.04 (s, 3H, CH3), 0.97 (s, 3H, CH3), 0.85 (s, 3H, CH3), 0.85 (s, 3H, CH3)。
13C NMR（126 MHz，CDCl3）：δ 171.71, 171.12, 156.89, 150.00, 130.14, 129.99, 114.69, 110.54, 81.05, 70.49, 62.68, 55.53, 50.42, 49.61, 46.49, 43.70, 42.84, 41.09, 38.54, 37.95, 37.69, 37.22, 34.52, 34.32, 31.52, 29.经过使用己烷/EtOAc（6:1）的柱层析纯化后，衍生物7以89%的产率获得，呈白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 6.87 – 6.85（m，2H，芳基），6.84 – 6.82（m，2H，芳基），5.08（d，J = 1.4 Hz，1H，H-29），5.00（s，1H，H-29），4.49 – 4.45（m，1H，H-3），4.42（s，2H，H-30），4.26（dd，J = 11.1, 1.2 Hz，1H，H-28），3.85（d，J = 11.0 Hz，1H，H-28），3.77（s，3H，CH3O），2.43（td，J = 11.2, 5.4 Hz，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.04（s，3H，CH3C═O），1.04（s，3H，CH3），0.97（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 171.73，171.15，154.03，153.20，150.13，115.75，114.77，110.53，81.06，71.11，62.69，55.89，55.54，50.44，49.63，46.49，43.66，42.85，41.10，38.55，37.96，37.70，37.23，34.53，34.33，31.54，29.94，28.10，27.21，26.88，23.85，21.46，21.18，21.09，18.32，16.64，16.32，16.22，14.93。红外光谱（DRIFT）：2939.65，2868.40，1731.40，1506.88，1228.97，1029.62。高分辨质谱（HRMS，ASAP，TOF ES+）：C41H61O6+ [M + H]+ 的理论值 649.4463；实测值 649.4421。

3β,28-二酰氧基-30-(3-甲氧基苯氧基) lup-20(29)-烯（化合物8）是根据Mitsunobu反应的一般步骤制备的。反应时间为1小时。经过使用己烷/EtOAc（6:1）的柱层析纯化后，衍生物8以70%的产率获得，呈白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 7.18（t，J = 8.2 Hz，1H，芳基），6.54 – 6.48（m，3H，芳基），5.08（d，J = 0.9 Hz，1H，H-29），5.01（s，1H，H-29），4.49 – 4.43（m，H-3，H-30），4.26（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），3.85（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），3.79（s，3H，CH3O），2.43（td，J = 11.2，5.4 Hz，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.04（s，3H，CH3C═O），1.04（s，3H，CH3），0.97（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）：δ 171.72，171.14，160.97，160.25，149.78，129.98，110.66，107.14，106.51，101.35，81.05，70.43，62.67，55.53，55.43，50.42，49.65，46.49，43.68，42.85，41.10，38.54，37.96，37.69，37.23，34.53，34.32，31.52，29.93，28.10，27.21，26.90，23.85，21.45，21.17，21.07，18.32，16.64，16.31，16.22，14.93。红外光谱（DRIFT）：2942.55，2868.40，1731.53，1592.49，1243.38，1149.33，1029.23。高分辨质谱（HRMS，ASAP，TOF ES+）：C41H61O6+ [M + H]+ 的理论值 649.4463；实测值 649.4459。

3β,28-二酰氧基-30-(2-甲氧基苯氧基) lup-20(29)-烯（化合物9）是根据Mitsunobu反应的一般步骤制备的。反应时间为1小时。经过使用己烷/EtOAc（6:1）的柱层析纯化后，衍生物9以76%的产率获得，呈白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 6.94 – 6.87（m，4H，芳基），5.09（d，J = 1.0 Hz，1H，H-29），5.00（s，1H，H-29），4.56（d，J = 13.5 Hz，1H，H-30），4.53（d，J = 13.5 Hz，1H，H-30），4.50 – 4.44（m，1H，H-3），4.26（dd，J = 11.1 Hz，1H，H-28），3.89 – 3.83（m，4H，H-28，CH3O），2.43（td，J = 11.2，5.4 Hz，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.04（s，3H，CH3C═O），1.04（s，3H，CH3），0.97（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）：δ 171.72，171.14，160.97，160.25，149.78，129.98，110.66，107.14，106.51，101.35，81.05，70.43，62.67，55.53，55.43，50.42，49.65，46.49，43.68，42.85，41.10，38.54，37.96，37.69，37.23，34.53，34.32，31.52，29.93，28.10，27.21，26.90，23.85，21.45，21.17，21.07，18.32，16.64，16.31，16.22，14.93。红外光谱（DRIFT）：2942.55，2868.40，1731.53，1592.49，1243.38，1149.33，1029.23。高分辨质谱（HRMS，ASAP，TOF ES+）：C41H61O6+ [M + H]+ 的理论值 649.4463；实测值 649.4459。

3β,28-二酰氧基-30-(4-甲酰基苯氧基) lup-20(29)-烯（化合物10）是根据Mitsunobu反应的一般步骤制备的。反应时间为1小时。经过使用己烷/EtOAc（6:1）的柱层析纯化后，衍生物10以69%的产率获得，呈白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 9.89（s，1H，CHO），7.85 – 7.82（m，2H，芳基），7.03 – 7.00（m，2H，芳基），5.09（d，J = 0.5 Hz，1H，H-29），5.06（s，1H，H-29），4.56（s，2H，H-30），4.49 – 4.44（m，1H，H-3），4.25（dd，J = 11.1，1.0 Hz，1H，H-28），3.86（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），2.44（td，J = 11.3，5.5 Hz，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.04（s，3H，CH3C═O），1.04（s，3H，CH3），0.97（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 190.88，171.71，171.13，163.94，149.04，132.11，120.88，113.83，112.07，110.11，81.06，71.33，62.69，56.06，55.54，50.42，49.78，46.51，43.37，42.84，41.10，38.54，37.96，37.67，37.22，34.50，34.32，31.50，29.93，28.10，27.21，26.87，23.84，21.45，21.17，21.07，18.32，16.64，16.31，16.21，14.91。红外光谱（DRIFT）：2941.55，2870.45，1731.73，1504.59，1241.33，1149.33，1029.23。高分辨质谱（HRMS，ASAP，TOF ES+）：C41H61O6+ [M + H]+ 的理论值 649.4463；实测值 649.4426。

3β,28-二酰氧基-30-(3-甲酰基苯氧基) lup-20(29)-烯（化合物11）是根据Mitsunobu反应的一般步骤制备的。反应时间为1小时。经过使用己烷/EtOAc（6:1）的柱层析纯化后，衍生物11以86%的产率获得，呈白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 9.98（s，1H，CHO），7.47 – 7.43（m，2H，芳基），7.42 – 7.39（m，1H，芳基），7.20（dt，J = 6.6, 2.6 Hz，1H，芳基），5.09（d，J = 0.9 Hz，1H，H-29），5.05（s，1H，H-29），4.54（s，2H，H-30），4.49 – 4.44（m，1H，H-3），4.26（dd，J = 11.1，0.9 Hz，1H，H-28），3.85（d，J = 11.0 Hz，1H，H-28），2.44（td，J = 11.3，5.4 Hz，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.04（s，3H，CH3C═O），1.04（s，3H，CH3），0.96（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 192.18，171.72，171.13，159.52，149.35，137.98，130.21，123.78，122.25，113.14，111.09，81.04，70.82，62.62，55.53，50.41，49.76，46.52，43.48，42.85，41.10，38.54，37.96，37.67，37.22，34.50，34.31，31.64，29.93，28.10，27.19，27.06，23.84，21.45，21.17，21.08，18.32，16.64，16.32，16.21，14.91。红外光谱（DRIFT）：2941.9，2870.45，1731.73，1595.6，1241.33，1157.89，1028.95。高分辨质谱（HRMS，ASAP，TOF ES+）：C41H59O6+ [M + H]+ 的理论值 647.4306；实测值 647.4312。

3β,28-二酰氧基-30-(4-甲酰基苯氧基) lup-20(29)-烯（化合物12）是根据Mitsunobu反应的一般步骤制备的。反应时间为1小时。经过使用己烷/EtOAc（6:1）的柱层析纯化后，衍生物12以67%的产率获得，呈白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 10.53（d，J = 0.7 Hz，1H，CHO），7.85（dd，J = 7.7，1.8 Hz，1H，芳基），7.54（ddd，J在使用己烷/EtOAc（6:1）进行柱层析纯化后， derivative 16 以82%的产率获得，为白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 8.01 – 7.97（m，2H，芳基），6.95 – 6.91（m，2H，芳基），5.08（d，J = 0.8 Hz，1H，H-29），5.04（s，1H，H-29），4.53（s，2H，H-30），4.49 – 4.44（m，1H，H-3），4.25（dd，J = 11.1, 1.0 Hz，1H，H-28），3.88（s，3H，CH3O），3.85（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），2.43（td，J = 11.2, 5.4 Hz，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.04（s，3H，CH3C═O），1.04（s，3H，CH3），0.97（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 171.72，171.15，166.99，162.68，149.27，131.73，122.90，114.46，111.17，81.04，70.73，62.62，55.54，52.00，50.42，49.74，46.51，43.43，42.85，41.10，38.54，37.95，37.65，37.22，34.51，34.32，31.68，29.93，28.09，27.17，27.13，23.83，21.46，21.18，21.03，18.32，16.64，16.32，16.21，14.91。IR（DRIFT）：2944.18，2870.45，1719.95，1604.96，1509.22，1240.56，1166.65，1104.39，1028.98。HRMS（ASAP，TOF ES+）：C42H61O7+ [M + H]+ 的计算值为677.4412；实测值为677.4384。

3β,28-二酰氧-30-(3-甲氧基羰基苯氧基)lup-20(29)-ene（17）：化合物17按照Mitsunobu反应的一般程序制备。反应时间为1小时。使用己烷/EtOAc（6:1）进行柱层析纯化后，derivative 17以91%的产率获得，为白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 7.63（d，J = 7.7 Hz，1H，芳基），7.57（s，1H，芳基），7.34（t，J = 7.9 Hz，1H，芳基），7.15 – 7.08（m，1H，芳基），5.09（s，1H，H-29），5.03（s，1H，H-29），4.52（s，2H，H-30），4.49 – 4.44（m，1H，H-3），4.26（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），3.88（s，3H，CH3O），3.85（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），2.43（td，J = 11.2，5.4 Hz，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.04（s，3H，CH3C═O），1.04（s，3H，CH3），0.97（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 171.72，171.13，167.09，158.91，149.53，131.59，129.54，122.27，120.28，115.03，110.89，81.05，70.76，62.65，55.53，52.32，50.41，49.72，46.50，43.48，42.85，41.10，38.54，37.95，37.68，37.22，34.51，34.32，31.63，29.94，28.10，27.20，27.02，23.84，21.45，21.17，21.08，18.32，16.64，16.32，16.22，14.91。IR（DRIFT）：2944.46，2872.49，1724.98，1585.16，1241.05，1029.46。HRMS（ASAP，TOF ES+）：C42H61O7+ [M + H]+ 的计算值为677.4412；实测值为677.4413。

3β,28-二酰氧-30-(2-甲氧基羰基苯氧基)lup-20(29)-ene（18）：化合物18按照Mitsunobu反应的一般程序制备。反应时间为1小时。使用己烷/EtOAc（6:1）进行柱层析纯化后，derivative 18以87%的产率获得，为白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 7.80（dd，J = 7.7, 1.6 Hz，1H，芳基），7.47 – 7.42（m，1H，芳基），7.00 – 6.95（m，2H，芳基），5.25（s，1H，H-29），5.04（s，1H，H-29），4.54（s，2H，H-30），4.50 – 4.43（m，1H，H-3），4.26（d，J = 11.0 Hz，1H，H-28），3.89（s，3H，CH3O），3.85（d，J = 11.3 Hz，1H，H-28），2.44（td，J = 10.8，5.2 Hz，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.04（s，3H，CH3C═O），1.04（s，3H，CH3），0.98（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 171.69，171.13，167.05，158.26，149.16，133.46，131.93，129.54，122.27，120.28，115.03，110.89，81.05，70.76，62.65，55.53，52.32，50.41，49.72，46.50，43.48，42.85，41.10，38.54，37.95，37.96，37.68，37.22，34.51，34.32，31.63，29.94，28.10，27.20，27.02，23.84，21.45，21.17，21.08，18.32，16.64，16.32，16.22，14.92。IR（DRIFT）：2944.46，2872.49，1724.98，1585.16，1241.05，1029.46。HRMS（ASAP，TOF ES+）：C42H61O7+ [M + H]+ 的计算值为677.4413。

3β,28-二酰氧-30-(4-氰基苯氧基)lup-20(29)-ene（19）：化合物19按照Mitsunobu反应的一般程序制备。反应时间为1小时。使用己烷/EtOAc（6:1）进行柱层析纯化后，derivative 19以53%的产率获得，为白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 7.60 – 7.57（m，2H，芳基），6.99 – 6.94（m，2H，芳基），5.07（s，1H，H-29），5.06（s，1H，H-29），4.52（s，2H，H-30），4.49 – 4.44（m，1H，H-3），4.24（d，J = 10.9 Hz，1H，H-28），3.85（d，J = 11.0 Hz，1H，H-28），2.42（td，J = 11.0，5.3 Hz，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.04（s，3H，CH3C═O），1.04（s，3H，CH3），0.97（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 171.73，171.16，162.18，148.87，134.14，119.32，115.57，111.50，104.31，81.02，71.00，62.56，55.54，50.42，49.81，46.51，43.28，42.84，41.10，38.53，37.96，37.65，37.65，37.22，34.49，34.32，31.59，29.94，29.85，28.10，27.20，27.16，26.99，23.84，21.45，21.17，21.07，18.32，16.64，16.31，16.21，14.92。IR（DRIFT）：2940.55，2868.40，1725.84，1599.49，1241.05，1029.46。HRMS（ASAP，TOF ES+）：C42H61O7+ [M + H]+ 的计算值为677.4412；实测值为677.4404。

3β,28-二酰氧-30-(4-氰基苯氧基)lup-20(29)-ene（20）：化合物20按照Mitsunobu反应的一般程序制备。反应时间为1小时。使用己烷/EtOAc（6:1）进行柱层析纯化后，derivative 20以80%的产率获得，为白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 7.39 – 7.35（m，1H，芳基），7.26 – 7.22（m，1H，芳基），7.18 – 7.13（m，2H，芳基），5.07（s，1H，H-29），5.06（s，1H，H-29），4.51 – 4.44（m，3H，H-3，H-30），4.25（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），3.85（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），2.42（td，J = 11.0，5.5 Hz，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.04（s，3H，CH3C═O），1.04（s，3H，CH3），0.97（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 171.72，171.14，159.00，149.00，130.48，124.81，120.19，118.85，117.76，113.39，111.31，81.03，71.03，62.57，55.54，50.41，49.81，46.51，43.32，42.84，41.10，38.54，37.95，37.95，37.65，37.22，34.51，34.32，31.68，29.93，29.84，28.10，27.17，27.20，26.99，23.84，21.45，21.17，21.07，18.31，16.64，16.32，16.21，14.92。IR（DRIFT）：2942.68，2872.49，2229.85，1730.24，1579.02，1240.12，1028.64。HRMS（ASAP，TOF ES+）：C41H58NO5+ [M + H]+ 的计算值为644.4310；实测值为644.4272。

3β,28-二酰氧-30-(3-氰基苯氧基)lup-20(29)-ene（21）：化合物21按照Mitsunobu反应的一般程序制备。反应时间为24小时。使用己烷/EtOAc（6:1）进行柱层析纯化后，derivative 21以66%的产率获得，为白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 7.57（dd，J = 7.7，1.7 Hz，1H，芳基），7.51（ddd，J = 8.5，7.通过使用己烷/EtOAc（3:1）的柱层析纯化后，衍生物25以78%的产率获得，为白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 9.85（s，1H，CHO），7.43 – 7.40（m，2H，芳基），6.97 – 6.94（m，1H，芳基），5.08（s，1H，H-29），5.05（s，1H，H-29），4.66 – 4.59（m，2H，H-30），4.49 – 4.44（m，1H，H-3），4.24（dd，J = 11.2, 1.1 Hz，1H，H-28），3.93（s，3H，CH3O），3.85（d，J = 11.0 Hz，1H，H-28），2.42（td，J = 11.1，5.2 Hz，1H，H-19），2.06（s，3H，CH3C═O），2.03（s，3H，CH3C═O），1.03（s，3H，CH3），0.96（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3），0.83（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）：δ 191.01，171.68，171.12，153.96，150.12，148.78，130.36，126.67，112.04，110.96，109.50，81.01，71.49，55.54，50.43，49.68，46.49，43.43，42.82，41.08，38.55，37.96，37.64，37.23，34.52，34.32，31.56，29.92，28.47，28.10，27.21，26.90，23.84，21.45，21.18，21.08，18.32，16.64，16.32，14.93。IR（DRIFT）：2941.56，2868.40，1731.39，1682.94，1585.65，1232.79，1133.54，1027.40。HRMS（ASAP，TOF ES+）：C42H61O7+ [M + H]+ 的计算值为677.4412；实测值为677.4416。

3β,28-二酰氧-30-{4-[(2E)-(甲氧羰基)苄基]苯氧}卢普-20(29)-烯（26）：根据Mitsunobu反应的一般程序制备。反应时间为1小时。通过使用己烷/EtOAc（4:1）的柱层析纯化后，衍生物26以84%的产率获得，为白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 7.64（d，J = 16.0 Hz，1H，乙烯基），7.48 – 7.45（m，2H，芳基），6.93 – 6.89（m，2H，芳基），6.30（d，J = 15.9 Hz，1H，乙烯基），5.07（d，J = 0.8 Hz，1H，H-29），5.03（s，1H，H-29），4.50（s，2H，H-30），4.48 – 4.44（m，1H，H-3），4.25（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），3.85（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），3.78（s，3H，CH3O），2.42（td，J = 11.2，5.2 Hz，1H，H-19），2.06（s，3H，CH3C═O），2.03（s，3H，CH3C═O），1.03（s，3H，CH3），0.96（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3），0.83（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 191.01，171.68，171.12，153.96，150.12，148.78，130.36，126.67，112.04，110.96，109.50，81.01，71.49，62.58，55.54，50.41，49.81，46.49，43.20，42.81，41.08，38.55，37.95，37.64，37.21，34.46，34.30，31.64，29.90，28.09，27.17，27.02，23.82，21.44，21.15，21.07，18.30，16.63，16.30，16.19，14.83。IR（DRIFT）：2943.97，2868.40，1731.39，1682.94，1585.65，1232.79，1133.54，1027.40。HRMS（ASAP，TOF ES+）：C44H63O7+ [M + H]+ 的计算值为703.4568；实测值为703.4550。

3β,28-二酰氧-30-(3-吡啶氧)卢普-20(29)-烯（27）：根据Mitsunobu反应的一般程序制备。反应时间为1小时。通过使用己烷/EtOAc（3:1）的柱层析纯化后，衍生物27以44%的产率获得，为白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 8.33（s，1H，芳基），8.24 – 8.21（m，1H，芳基），7.23 – 7.21（m，2H，芳基），5.09（d，J = 0.8 Hz，1H，H-29），5.05（s，1H，H-29），4.52（s，2H，H-30），4.48 – 4.44（m，1H，H-3），4.25（dd，J = 11.1 Hz，1H，H-28），3.85（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），2.43（td，J = 11.2，5.4 Hz，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.03（s，3H，CH3C═O），1.03（s，3H，CH3），0.96（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3），0.83（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 171.68，171.10，167.86，160.73，149.37，144.62，129.82，127.39，115.48，115.19，111.06，81.00，70.64，62.58，55.50，51.68，50.39，49.67，46.47，43.46，42.81，41.06，38.53，37.92，37.64，37.19，34.48，34.29，31.58，29.90，29.81，28.07，27.16，26.97，23.80，21.42，21.14，21.06，18.28，16.61，16.29，16.18，14.89。IR（DRIFT）：2943.97，2870.45，1730.15，1602.14，1509.27，1240.01，1163.99，1028.88。HRMS（ASAP，TOF ES+）：C44H63O7+ [M + H]+ 的计算值为703.4550。

3β,28-二酰氧-30-(4-烯丙基-2-甲氧基苯氧)卢普-20(29)-烯（28）：根据Mitsunobu反应的一般程序制备。反应时间为1小时。通过使用己烷/EtOAc（8:1）的柱层析纯化后，衍生物28以84%的产率获得，为白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 6.80（d，J = 8.1 Hz，1H，芳基），6.72 – 6.67（m，2H，芳基），5.96（ddt，J = 16.7，10.0，6.7 Hz，1H，乙烯基），5.10 – 5.04（m，3H，乙烯基，H-29），4.99（s，1H，H-29），4.56 – 4.44（m，3H，H-3，H-30），4.26（d，J = 11.2 Hz，1H，H-28），3.88 – 3.83（m，4H，H-28，CH3O），3.33（d，J = 6.7 Hz，2H，苄基），2.42（td，J = 11.2，5.3 Hz，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.04（s，3H，CH3C═O），1.03（s，3H，CH3），0.96（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 171.70，171.13，149.75，149.67，146.91，137.83，133.26，120.51，121.66，111.20，81.02，70.94，62.59，55.52，50.41，49.67，46.51，42.84，41.09，38.55，37.95，37.96，37.68，37.22，34.50，34.32，31.48，29.92，29.85，28.10，27.21，26.85，23.85，21.46，21.18，21.08，18.33，16.65，16.61，16.29，16.18，14.90。IR（DRIFT）：2940.39，2872.49，1731.08，1574.93，1509.27，1240.01，1163.99，1028.88。HRMS（ASAP，TOF ES+）：C44H65O6+ [M + H]+ 的计算值为689.4776；实测值为689.4749。

3β,28-二酰氧-30-{4-[(2′S)-2′-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧丙基]苯氧}卢普-20(29)-烯（29）：根据Mitsunobu反应的一般程序制备。反应时间为1小时。通过使用己烷/EtOAc（4:1至3:1）的梯度柱层析纯化后，衍生物29以89%的产率获得，为白色固体。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 7.05 – 7.01（m，2H，芳基），6.86 – 6.82（m，2H，芳基），5.07（d，J = 0.9 Hz，1H，H-29），5.01（s，1H，H-29），4.95（d，J = 8.4 Hz，1H），4.59 – 4.50（m，1H），4.49 – 4.42（m，3H，H-3，H-30），4.26（dd，J = 11.2，0.9 Hz，1H，H-28），3.85（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），3.71（s，3H，CH3O），3.13 – 2.93（m，2H），2.43（td，J = 11.2，5.3 Hz，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.04（s，3H，CH3C═O），1.42（s，9H，3 × CH3），1.04（s，3H，CH3），0.97（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3）。13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 171.70，171.12，155.14，149.19，142.28，138.13，123.98，121.66，111.20，81.02，70.94，62.59，55.52，50.41，49.77，46.51，42.84，41.09，38.55，37.95，37.96，37.65，37.22，34.50，34.32，31.56，29.93，29.84，28.09，27.17，27.06，23.83，21.44，21.16，21.07，18.31，16.63，16.31，16.21，14.90。IR（DRIFT）：2940.39，2872.49，1731.08，1574.93，1230.98，1027.85。HRMS（ASAP，TOF ES+）：C39H58NO5+ [M + H]+ 的计算值为620.4310；实测值为620.4红外光谱（DRIFT）：2942.95, 2870.45, 2364.93, 1727.18, 1454.18, 1240.92, 1105.23, 1029.76。高分辨率质谱（HRMS，ASAP，TOF ES+）：C42H58NO6+ [M + H]+ 的理论质量为 672.4259；实测质量为 672.4255。3β,28-二酰氧基-30-(2-呋喃氧基)卢普-20(29)-烯（化合物 34）根据 Mitsunobu 反应的通用程序制备。反应时间为 1 小时。使用己烷/EtOAc（3:1）进行柱色谱纯化后，化合物 34 以 60% 的产率获得，为白色固体。1H 核磁共振（1H NMR，500 MHz，CDCl3）：δ 7.59（dd，J = 1.7, 0.9 Hz，1H，芳基），7.19（dd，J = 3.5, 0.9 Hz，1H，芳基），6.52（dd，J = 3.5, 1.7 Hz，1H，芳基），5.04（d，J = 0.9 Hz，1H，H-29），5.01（s，1H，H-29），4.80（d，J = 13.5 Hz，1H，H-30），4.76（d，J = 13.5 Hz，1H，H-30），4.49 – 4.45（m，1H，H-3），4.25（dd，J = 11.1, 1.1 Hz，1H，H-28），3.83（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），2.42（td，J = 10.8, 5.2 Hz，1H，H-19），2.06（s，3H，CH3C = O），2.04（s，3H，CH3C = O），1.03（s，3H，CH3），0.96（s，3H，CH3），0.85（s，3H，CH3），0.84（s，3H，CH3），0.83（s，3H，CH3）。13C 核磁共振（13C NMR，126 MHz，CDCl3）：δ 171.69，171.12，158.52，148.65，146.58，144.78，118.15，112.02，111.33，81.03，66.49，62.64，55.51，50.38，49.75，46.50，44.01，42.82，41.07，38.55，37.96，37.68，37.22，34.52，34.29，31.36，29.91，28.10，27.18，26.75，23.84，21.45，21.16，21.05，18.31，16.65，16.30，16.20，14.87。红外光谱（DRIFT）：2944.27，2870.45，1728.78，1581.07，1472.66，1230.61，1176.99，1114.27，1029.12。高分辨率质谱（HRMS，ASAP，TOF ES+）：C39H57O7+ [M + H]+ 的理论质量为 637.4099；实测质量为 637.4103。3β,28-二酰氧基-30-(丁酰氧基)卢普-20(29)-烯（化合物 35）根据 Mitsunobu 反应的通用程序制备。反应时间为 1 小时。使用己烷/EtOAc（7:1）进行柱色谱纯化后，化合物 35 以 85% 的产率获得，为白色固体。1H 核磁共振（1H NMR，500 MHz，CDCl3）：δ 4.95（s，1H，H-29），4.94（d，J = 1.0 Hz，1H，H-29），4.58（d，J = 13.6 Hz，1H，H-30），4.53（d，J = 13.6 Hz，1H，H-30），4.50 – 4.44（m，1H，H-3），4.24（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），3.82（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），2.41 – 2.30（m，3H，H-19，CH2），2.07（s，3H，CH3C═O），2.04（s，3H，CH3C═O），1.03（s，3H，CH3），0.98 – 0.95（m，6H，2 × CH3），0.87 – 0.84（m，6H，2 × CH3），0.83（s，3H，CH3）。13C 核磁共振（13C NMR，126 MHz，CDCl3）：δ 173.48，171.72，171.14，149.09，110.67，81.04，65.93，62.62，55.52，50.40，49.63，46.48，44.05，42.82，41.08，38.55，37.96，37.67，37.22，36.42，34.52，34.30，31.28，29.91，28.09，27.18，26.71，23.84，21.45，21.17，21.05，18.57，18.31，16.64，16.31，16.20，14.87。红外光谱（DRIFT）：2941.67，2872.49，1732.40，1455.38，1238.08，1169.39，1027.74。高分辨率质谱（HRMS，ASAP，TOF ES+）：C38H61O6+ [M + H]+ 的理论质量为 613.4463；实测质量为 613.4464。3β,28-二酰氧基-30-{(2′S)-2′-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酰氧基}卢普-20(29)-烯（化合物 36）根据 Mitsunobu 反应的通用程序制备。反应时间为 1 小时。使用己烷/EtOAc（6:1）进行柱色谱纯化后，化合物 36 以 84% 的产率获得，为白色固体。1H 核磁共振（1H NMR，500 MHz，CDCl3）：δ 5.04（d，J = 5.1 Hz，1H，NH），4.96（s，1H，H-29），4.94（s，1H，H-29），4.67 – 4.54（m，2H，H-30），4.50 – 4.43（m，1H，H-3），4.40 – 4.29（m，1H），4.25（d，J = 10.9 Hz，1H，H-28），3.81（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），2.35（td，J = 10.4, 5.2 Hz，1H，H-19），2.06（s，3H，CH3C═O），2.03（s，3H，CH3C═O），1.44（s，9H，3 × CH3），1.03（s，3H，CH3），0.97（s，3H，CH3），0.86 – 0.84（m，6H，2 × CH3），0.83（s，3H，CH3）。13C 核磁共振（13C NMR，126 MHz，CDCl3）：δ 173.18，171.67，171.13，155.20，148.51，148.46，110.75，81.03，66.96，62.56，55.51，50.37，49.70，49.46，46.49，43.83，42.82，41.07，38.54，37.95，37.62，37.67，37.22，34.48，34.29，31.35，31.29，29.89，28.09，27.18，26.71，23.84，21.45，21.17，21.05，18.57，18.31，16.64，16.31，16.20，14.91，13.89。红外光谱（DRIFT）：2941.67，2872.49，1732.40，1455.38，1238.08，1169.39，1027.74。高分辨率质谱（HRMS，ASAP，TOF ES+）：C38H61O6+ [M + H]+ 的理论质量为 613.4463；实测质量为 613.4464。3β,28-二酰氧基-30-{(2′S)-2′-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酰氧基}卢普-20(29)-烯（化合物 37）的反应在惰性条件下进行。将化合物 36（174 mg，0.244 mmol）溶解在 TFA（500 μL）和 DCM（500 μL）中。反应混合物在室温下搅拌 0.5 小时。通过使用己烷/EtOAc（6:1）作为流动相的 TLC 分析确定反应完成后，将反应混合物用 DCM（30 mL）稀释。有机相用饱和 NaHCO3 溶液（10 mL）洗涤三次，然后用 H2O（10 mL）洗涤一次，再用盐水（10 mL）洗涤一次。有机相用无水 MgSO4 干燥，随后在减压下使用旋转蒸发器去除有机溶剂，接着通过 SiO2 进行柱色谱纯化，洗脱剂为 EtOAc。纯化过程后，化合物 37 以 87% 的产率获得，为白色固体。1H 核磁共振（1H NMR，500 MHz，CDCl3）：δ 4.97（s，1H，H-29），4.94（d，J = 0.8 Hz，1H，H-29），4.63 – 4.55（m，2H，H-30），4.49 – 4.44（m，1H，H-3），4.24（dd，J = 11.1 Hz，1H，H-28），3.82（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），3.59（q，J = 7.1 Hz，1H，R-CH-NH2），2.39 – 2.31（m，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.03（s，3H，CH3C═O），1.36（d，J = 7.0 Hz，3H，CH3），1.03（s，3H，CH3），0.97（s，3H，CH3），0.86 – 0.84（m，6H，2 × CH3），0.83（s，3H，CH3）。13C 核磁共振（13C NMR，126 MHz，CDCl3）：δ 173.18，171.67，171.13，155.20，148.51，148.46，110.75，81.03，80.00，66.96，62.56，55.51，50.37，49.70，49.46，46.49，42.82，41.08，38.55，37.95，37.62，37.64，37.22，34.48，34.29，31.35，31.29，29.89，28.09，27.17，26.86，23.83，21.45，21.16，21.05，18.91，18.31，16.64，16.31，16.20，14.90。红外光谱（DRIFT）：2940.00，2868.40，1732.58，1507.39，1239.49，1159.59，1028.02。高分辨率质谱（HRMS，ASAP，TOF ES+）：C42H68NO8+ [M + H]+ 的理论质量为 714.4939；实测质量为 714.4946。3β,28-二酰氧基-30-[(2S)-2-氨基丙酰氧基]卢普-20(29)-烯（化合物 37）的合成：将化合物 36（174 mg，0.244 mmol）溶解在 TFA（500 μL）和 DCM（500 μL）中。反应混合物在室温下搅拌 0.5 小时。通过使用己烷/EtOAc（6:1）作为流动相的 TLC 分析确定反应已完成。将反应混合物用 DCM（30 mL）稀释。有机相用饱和 NaHCO3 溶液（10 mL）洗涤三次，用 H2O（10 mL）洗涤一次，再用盐水（10 mL）洗涤一次。有机相用无水 MgSO4 干燥，然后在减压下使用旋转蒸发器去除有机溶剂，接着通过 SiO2 进行柱色谱纯化，洗脱剂为 EtOAc。纯化过程后，化合物 37 以 87% 的产率获得，为白色固体。1H 核磁共振（1H NMR，500 MHz，CDCl3）：δ 4.97（s，1H，H-29），4.94（d，J = 0.8 Hz，1H，H-29），4.63 – 4.55（m，2H，H-30），4.49 – 4.44（m，1H，H-3），4.24（dd，J = 11.1，1.0 Hz，1H，H-28），3.82（d，J = 11.1 Hz，1H，H-28），3.59（q，J = 7.1 Hz，1H，R-CH-NH2），2.39 – 2.31（m，1H，H-19），2.07（s，3H，CH3C═O），2.03（s，3H，CH3C═O），1.36（d，J = 7.0 Hz，3HA549细胞系代表肺腺癌。BJ和MRC-5人成纤维细胞作为非肿瘤对照细胞被纳入实验。所有细胞均按照ATCC或Horizon Discovery的建议，在75平方厘米的组织培养瓶中用适当的培养基（含有5克/升葡萄糖、2毫摩尔/升谷氨酰胺、100微克/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、10%胎牛血清和NaHCO3的DMEM或RPMI 1640培养基）进行培养。MTS细胞毒性检测按照我们的既定方案进行三次独立实验，细胞活力根据标准程序进行量化。

**细胞周期和凋亡分析：**
细胞周期分布和凋亡（亚G1期）通过流式细胞术进行评估。CCRF-CEM细胞以5×10^5个细胞/毫升的密度接种到六孔板中，并分别用1×或5× IC50浓度的测试化合物处理24小时。细胞在含有10%胎牛血清、100微克/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的RPMI 1640培养基中，在标准条件（37°C，5% CO2）下培养。同时设置一个空白对照组（仅用培养基处理）。处理后，收集细胞，用冰冷的PBS洗涤，然后在-20°C下用70%乙醇固定过夜。固定后的细胞用低渗柠檬酸缓冲液洗涤，加入RNase A（50微克/毫升）孵育，再用碘化丙啶染色以分析总DNA含量。流式细胞术检测使用的是Becton Dickinson公司的FACSCalibur仪器和488纳米的激发激光。数据通过Kaluza软件（Beckman Coulter）进行处理，以确定细胞周期各阶段的比例并量化凋亡的亚G1期细胞群体。

**DNA合成分析：**
细胞在相同的条件下进行培养和处理。为了评估DNA合成， cells在收获前用10微摩尔/升的5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）进行脉冲标记30分钟。标记后，细胞用胰蛋白酶处理，用冰冷的70%乙醇固定，并在冰上孵育30分钟。接着在室温下用2摩尔/升的HCl变性30分钟，然后用0.1摩尔/升的四硼酸钠（Na2B4O7）中和。用含有0.5% Tween-20和1% BSA的PBS洗涤后，用初级抗BrdU抗体（EXBIO）检测BrdU的掺入量，再结合FITC标记的二级抗小鼠抗体（Sigma）进行检测，所有孵育步骤均在室温避光条件下完成。最后，细胞用碘化丙啶（0.1毫克/毫升）复染，并用RNase A（0.5毫克/毫升）处理1小时。流式细胞术分析同样使用Becton Dickinson公司的FACSCalibur仪器和488纳米激光完成。

**RNA合成分析：**
细胞在相同的条件下进行培养和处理。为了评估RNA合成，细胞在收获前用1摩尔/升的5-溴尿苷（BrU）进行脉冲标记30分钟。标记后，细胞用含0.05% NP-40的1%戊二醛（PBS缓冲液）固定15分钟，并在4°C下过夜以增强固定效果。残留的醛基团用PBS中的1%甘氨酸进行淬灭，随后用PBS洗涤。BrU的掺入量通过初级抗BrdU抗体（EXBIO；该抗体对BrU也有交叉反应）和FITC标记的二级抗小鼠抗体（Sigma）进行检测，所有孵育步骤均在室温避光条件下完成。为了稳定荧光，细胞用1%戊二醛和0.05% NP-40进行二次固定。最后，细胞用碘化丙啶（0.1毫克/毫升）染色，并用RNase A（0.5毫克/毫升）处理1小时，同样在室温避光条件下完成流式细胞术分析。