《Frontiers in Oncology》：Research progress on early diagnostic biomarkers and liquid biopsy technologies for colorectal cancer: a comprehensive review
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本篇综述系统总结了液体活检在结直肠癌(CRC)早期诊断领域的最新进展。文章深入剖析了循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞(CTCs)、细胞外囊泡(EVs)及蛋白/微生物标志物这四大类标志物各自的生物学机制、临床性能、优势与局限，并对相应的检测技术进行了批判性评估。综述强调了整合多标志物与人工智能(AI)是克服当前早期CRC诊断中标志物丰度低、肿瘤异质性等挑战的未来方向，旨在推动这些创新技术向临床实践的转化。
液体活检技术，特别是通过分析血液等体液来捕捉癌症信号的“液体活检”，正在为结直肠癌(CRC)的早期诊断带来革命性的希望。结直肠癌是全球发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤，其预后与诊断时的分期密切相关。早期（0–I期）发现能将5年生存率提升至90%以上，而晚期（III–IV期）则骤降至15%以下。然而，目前临床常规的筛查工具，如作为“金标准”的结肠镜检查，虽有较高准确性，但因其侵入性、复杂的肠道准备要求和潜在的并发症风险，导致患者依从性不佳。相比之下，液体活检凭借其无创、可实时监测、可进行多分析物检测等优势，展现出了巨大的应用潜力。
早期诊断生物标志物
液体活检的核心在于对血液中各类肿瘤相关分析物的捕获与分析。目前，研究聚焦于四大类标志物。
循环肿瘤DNA
ctDNA是肿瘤细胞释放到血液循环中的DNA片段，在早期结直肠癌患者血液中仅占循环游离DNA(cfDNA)的0.01%-0.1%。其诊断价值源于其中携带的CRC特异性遗传和表观遗传学改变。其中，体细胞突变（如APC、KRAS、BRAF基因突变）是最早被深入研究的标志物。一项纳入1000名无症状受试者的前瞻性研究表明，通过检测ctDNA中的APC、KRAS和BRAF突变，可实现对I期结直肠癌87%的检出率，以及对直径大于10毫米的进展期腺瘤92%的检出率，特异性高达99.3%。值得注意的是，ctDNA甚至能识别出12%因结肠镜视野盲区而被漏诊的进展期腺瘤。然而，单一基因突变检测的覆盖面有限，例如KRAS突变仅在约40%的CRC病例中存在，这凸显了多标志物组合策略的必要性。
相比之下，DNA甲基化（如SEPT9、NDRG4基因的甲基化）作为一种更稳定、在癌变早期就出现的改变，展现出独特的优势。甲基化检测的代表性产品Epi proColon?已成为首个获批用于CRC筛查的ctDNA检测方法。一项荟萃分析显示，其对I期CRC的灵敏度为73%，对II-III期则可达91%。2024年的一项研究将SEPT9与NDRG4甲基化检测结合，对I期CRC的灵敏度提升至85%。其背后的机制在于，肿瘤抑制基因的异常沉默（甲基化）通常发生在基因突变积累之前，从而为更早期的疾病检测提供了可能。
尽管前景广阔，ctDNA用于早期CRC检测的领域成熟度仍受限于多项因素，包括大多数研究为回顾性、样本量有限、以及早期病灶ctDNA丰度过低带来的技术挑战。大规模前瞻性试验对于确立其临床效用至关重要。
循环肿瘤细胞
CTCs是从原发或转移病灶脱落进入血液循环的完整肿瘤细胞。在早期结直肠癌患者血液中，其浓度极低，约为每毫升1-10个。CTCs的稀有性（大约每10亿个血细胞中才有1个）要求检测技术必须具备高效的富集能力。传统的CellSearch?系统（FDA已批准用于CRC预后评估）采用基于上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体的免疫磁珠富集，但受限于部分早期病灶上皮-间质转化(EMT)过程中EpCAM表达下调，其对I期CRC的检出率仅为30-40%。
新型富集技术显著提升了早期CTC的检出性能。例如，基于细胞大小的过滤技术(ISET?)可捕获到60-65%的I期CRC患者CTC。结合免疫磁性与尺寸分选的微流控芯片(CTC-iChip)则将检出率提升至70%。更进一步，结合RNA适配体的微流控系统，通过减少抗体偏倚，可捕获更多异质性CTC亚群，对I期疾病的检出率达到70-75%。
除了计数，对CTC进行分子分型（如检测KRAS突变、分析基因表达谱）可进一步提高诊断准确性。例如，在CTC中检测KRAS突变，对I期CRC的灵敏度可达72%；而通过分析CTC中MACC1、S100A4等基因的表达特征，可有效区分CRC与良性结直肠疾病。然而，该领域同样面临技术标准化不足、CTC生物学意义（是否均具有转移潜能）尚不完全明确等挑战。
细胞外囊泡
EVs是所有细胞（包括肿瘤细胞）释放的、由脂质膜包裹的囊泡，其内携带着蛋白质、核酸等多种CRC特异性分子。由于有脂膜保护，其中的miRNA等分子非常稳定。在蛋白标志物方面，癌胚抗原(CEA)和EpCAM在EV中富集，当两者组成联合检测panel时，对I期CRC的检出率达82%。在核酸标志物方面，微小RNA(miRNA)是研究热点，其中miR-21和miR-92a是研究最充分的EV来源标志物。一项2024年的荟萃分析表明，EV-miR-21/92a组合对I期CRC的灵敏度为80%。
然而，EV生物标志物领域最大的挑战在于缺乏标准化的分离方法。超速离心、聚合物沉淀、尺寸排阻色谱等不同方法得到的EV在纯度和成分上差异很大，导致研究结果难以比较和重复。建立统一的技术规范是推进其临床转化的当务之急。
循环蛋白与微生物标志物
传统的循环蛋白肿瘤标志物，如CEA，对早期CRC的灵敏度较低（I期<50%）。将CEA与CA19-9、骨桥蛋白(OPN)或基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等新型蛋白标志物联合，可在一定程度上提升灵敏度。
近年来，基于肠道菌群与CRC发生发展的密切关系，微生物标志物成为一个新兴方向。例如，具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)在CRC组织中富集，其细胞游离微生物DNA(cfmDNA)可在患者血浆中被检测到，一项2023年的研究显示其对I期CRC的检出率为75%。此外，肠道菌群代谢产生的短链脂肪酸（如丁酸盐）在早期CRC患者血浆中水平显著降低，也可作为诊断标志物。将两者结合，对I期CRC的灵敏度可达82%。不过，微生物标志物研究尚处于早期阶段，其性能受饮食、人群差异等因素影响较大，需要更大规模的验证。
液体活检检测技术
不同的生物标志物需要相应的检测技术来“解码”。
ctDNA检测技术
数字液滴PCR(ddPCR)通过将样本分割成数万个液滴进行独立PCR扩增，能实现对低频突变（如KRAS G12D）的高灵敏、绝对定量检测，成本较低，但其多重检测能力有限。新一代测序(NGS)则能同时检测大量基因的突变、拷贝数变异和甲基化位点，提供全面的分子图谱，但成本较高。对于甲基化检测，重亚硫酸盐测序是常用技术，但其处理过程会导致大量DNA降解。新兴的酶学甲基化测序和纳米孔测序等技术有望提供更优的替代方案。所有这些技术都共同面临着早期ctDNA丰度过低（接近或低于检测下限）的终极挑战。
CTC检测技术
除了上述富集技术，对捕获到的CTC进行分子分析需要借助免疫荧光/免疫组化(IF/IHC)进行鉴定和蛋白标记物检测，或通过逆转录PCR(RT-PCR)和单细胞NGS(scNGS)进行基因表达和突变分析。单细胞NGS尤其强大，可揭示早期CRC的瘤内异性和克隆演化过程，但技术复杂且昂贵。
EV检测技术
EV研究的第一步是分离，除超速离心外，尺寸排阻色谱能获得更高纯度的EV。分离后，可采用酶联免疫吸附测定(ELISA)等免疫学方法检测EV携带的蛋白（如CEA），或采用定量PCR(qPCR)和NGS检测EV内的miRNA。小RNA测序可用于发现新的miRNA标志物谱。目前，该领域最大的瓶颈在于从样本处理到EV分离、分析均缺乏统一标准，严重影响了结果的可靠性和可比性。
面临的挑战与未来方向
尽管进展迅速，液体活检用于CRC早期诊断仍面临几大核心挑战：早期病灶生物标志物丰度极低；肿瘤存在高度异质性；从样本采集到分析的技术流程缺乏标准化，导致结果可变性大；大规模前瞻性临床验证数据依然缺乏；以及当前许多技术（尤其是NGS）成本高昂。
为了突破这些瓶颈，未来的发展将聚焦于以下几个方向：
- 1.
多标志物整合与数据融合：将ctDNA、CTCs、EVs和蛋白质等不同维度的标志物信息相结合，并利用人工智能(AI)和机器学习(ML)算法进行综合分析，有望在保持高特异性的同时，大幅提升对早期CRC的检出率。初步研究显示，深度学习模型整合ctDNA甲基化和EV-miRNA数据，对I期CRC的灵敏度可达92%。
- 2.
单细胞与单分子技术：单细胞测序能深入解析CTC的异质性，而纳米孔测序等单分子技术无需重亚硫酸盐处理即可直接读取DNA甲基化信息，这些技术有助于在最低限度样本中获取最精准的信息。
- 3.
床旁检测设备与可及性：开发微型化、低成本、快速出结果的床旁检测设备，是推动液体活检普及、惠及更广泛人群的关键。微流控芯片、侧向流免疫层析试纸条乃至智能手机集成检测系统都是活跃的研究方向。
- 4.
临床整合与卫生经济学：液体活检需要明确的临床应用定位，是替代现有的粪便免疫化学试验(FIT)，还是作为结肠镜检查前的分流工具？同时，必须进行严格的成本效益分析，证明其在改善健康结局的同时具有经济性，才能获得医保支付和广泛采纳。
- 5.
人工智能与计算生物学：AI在液体活检中的应用已超越数据整合，扩展到从噪音中增强癌症信号、基于多组学数据进行个体化风险预测、乃至预测治疗反应等多个层面。然而，AI模型的可解释性、泛化能力和监管路径仍是需要解决的问题。
- 6.
大规模临床试验：最终，液体活检的价值必须通过大规模随机对照试验来证实。目前已有数项涉及数万参与者的临床试验正在进行，它们将回答关于液体活检筛查CRC的真实灵敏度、特异性、间期癌发生率以及成本效益等核心问题，其结果将在未来几年内为临床指南的制定提供决定性证据。
结论
总而言之，液体活检通过无创方式捕捉血液中痕量的肿瘤信号，为结直肠癌的早期诊断开启了新篇章。ctDNA、CTCs、EVs及蛋白/微生物标志物各具优势，但也都面临各自的生物学和技术局限。整合多维度标志物的检测panel，结合日新月异的检测技术（尤其是单分子和床旁设备）和强大的AI数据分析能力，是未来发展的大势所趋。当前正在开展的大规模临床试验将为其临床转化铺平道路。未来5-10年，液体活检有望成为结直肠癌筛查体系中的重要组成部分，与现有手段互补或部分替代，最终实现更早发现、精准分层和改善患者预后的目标。
