《Frontiers in Physiology》：Innovations in skeletal muscle regeneration: from physiology to bioengineering approaches for repair and restoration
1 引言
骨骼肌是人体内含量最丰富的组织，约占成人体重的40-50%，在运动、体温调节和代谢稳态中扮演关键角色。然而，严重的创伤，例如容积性肌肉损失（Volumetric Muscle Loss, VML，定义为肌肉体积损失≥20%），会完全压倒其固有的再生能力。当前的临床策略，如自体肌肉皮瓣，仅能实现部分的结构和功能恢复，凸显了对再生医学策略的迫切需求。骨骼肌组织工程（Skeletal Muscle Tissue Engineering, SMTE）应运而生，旨在开发能够支持、增强乃至加速再生过程的人造生物构建体。在各种生物材料中，水凝胶因其可注射性、可调节的生化与生物力学特性，以及封装和递送治疗性细胞与生长因子的能力，受到了广泛关注。它们能够模拟细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）的关键特征，为细胞粘附、增殖和成肌分化（myogenesis）提供支持。
2 从损伤到新生：骨骼肌再生的序贯阶段
骨骼肌的再生能力主要归功于其驻留的干细胞——卫星细胞（Satellite Cells, SCs，也称为肌肉干细胞MuSCs）。在静息状态下，SCs位于肌纤维的基膜下，表达标志物配对盒蛋白7（Paired box protein 7, Pax7）。损伤发生后，再生过程会经历一系列协调且重叠的阶段。
首先是炎症阶段。损伤导致肌纤维坏死，引发急性炎症反应。损伤后数小时，中性粒细胞浸润，随后募集的单核细胞分化为巨噬细胞。早期，促炎的M1型巨噬细胞负责清除坏死碎片并激活SCs；随后，它们及时向修复性的M2型表型转换，分泌诸如胰岛素样生长因子-1（Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1）、白细胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）等营养因子来支持组织修复。巨噬细胞的这种表型及时转换对成功再生至关重要。
接着是激活与增殖阶段。来自生长因子（如肝细胞生长因子Hepatocyte Growth Factor, HGF、成纤维细胞生长因子-2 Fibroblast Growth Factor-2, FGF-2）和免疫细胞释放的细胞因子，刺激静息的Pax7+SCs退出G0期。激活后的SCs开始共表达Pax7与生肌调节因子（Myogenic Regulatory Factors, MRFs），如生肌分化因子（Myogenic Differentiation, MyoD）和生肌因子5（Myogenic Factor 5, Myf5）。Notch信号通路在维持SCs静息中起关键作用，损伤后其活性下降，促使细胞向生肌谱系分化。
然后是分化与融合阶段。增殖的成肌细胞退出细胞周期，开始分化。此阶段的特点是Pax7表达下调，以及分化标志物如肌细胞生成素（Myogenin, MyoG）和晚期MRFs（如MRF4）的诱导表达。成肌细胞在白细胞介素-4（IL-4）、IL-13等细胞因子的促进下，相互融合形成多核的肌管，或与现有肌纤维融合。约在损伤后4-7天，可观察到表达胚胎肌球蛋白重链（embryonic myosin heavy chain, MyHC）的新生肌管。
最后是成熟与重塑阶段。这一阶段持续数周，新形成的肌管成熟为功能性肌纤维。同时，成纤维细胞和纤维/脂肪源性祖细胞（Fibro/Adipogenic Progenitors, FAPs）协调ECM的重塑，沉积和优化胶原基质，重建基膜。血管再生和神经再支配也在此阶段发生，以恢复血液供应和神经肌肉连接，最终实现肌肉结构和功能的基本恢复。
3 肌肉修复与再生的分子调控
肌肉再生过程受到一个由基因、信号通路和细胞因子组成的网络的精确调控。
Pax7与生肌调节因子（MRFs）：Pax7是SCs的经典标志物，对维持干细胞库和再生不可或缺。激活后，SCs上调MRFs，包括标记早期分化的Myf5和MyoD，以及驱动终末分化的MyoG和参与肌纤维成熟的MRF4。MyoD被称为生肌过程的“主调控因子”。
Notch信号通路：在未受伤的肌肉中，Notch信号通过维持Pax7表达来保持SCs的静息状态，防止其过早分化。损伤后，Notch活性降低，而促分化信号（如Wnt）增强，从而允许SCs激活。Notch还通过调节下游靶点来平衡SCs的自我更新与分化。
炎症细胞因子：损伤早期，由浸润的M1型巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）和IL-6，在可控水平下能刺激SCs增殖和早期分化。然而，这些细胞因子的慢性升高则有害。及时的炎症消退和向促修复环境的转换至关重要。
生长因子与再生信号：损伤后释放的多种生长因子协同调控再生。HGF是最早激活静息SCs的信号之一；FGF-2作为促有丝分裂原，促进SCs增殖；IGF-1在后期阶段增强成肌细胞的分化、存活和肥大。相反，转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-beta 1, TGF-β1）则通过促进成纤维细胞活化和瘢痕形成来抑制肌肉修复。维持促生肌信号（如IGF-1, HGF, FGF）与促纤维化信号（如TGF-β1）之间的微妙平衡，对于防止纤维化、确保组织正常再生至关重要。
再生微环境中的细胞间相互作用：肌肉再生是一个多细胞协同的过程。除了免疫细胞，血管内皮细胞通过释放血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）等营养因子支持修复。成纤维细胞和FAPs提供了ECM支架并分泌促生肌信号，但其过度激活会导致过度的胶原沉积和瘢痕形成。
4 容积性肌肉损失后的再生障碍
VML损伤由于其巨大的组织缺损，导致内源性再生失败，其愈合过程异常，常以广泛的纤维化、有限的肌纤维再生和较差的功能恢复为特征。
再生微环境的丧失：VML损伤通常完全破坏了包含基膜、血管、神经和驻留SCs在内的结构性及细胞性要素。没有了这个再生微环境，肌源性祖细胞缺乏粘附、生长和分化的支架与机械引导。
异常的炎症与纤维化：VML会引发持久且失调的炎症反应，使愈合向纤维化倾斜。促再生细胞因子（如IGF-1, HGF）经常下调或缺失，而TGF-β1的表达显著升高。过度的TGF-β1信号驱动成纤维细胞活化和ECM沉积，同时巨噬细胞极化紊乱，FAPs凋亡受损，共同导致了纤维化的恶性循环。一旦纤维化过程占据主导，微环境就对生肌过程变得极为不利。
持久的功能缺陷：临床上，VML导致肌纤维缺失、过度纤维化以及缺乏血管化和神经支配，共同造成了显著且可能永久性的功能损害，如收缩力下降、活动范围减小，甚至肌肉挛缩。
治疗策略与新兴干预手段：鉴于自然修复的局限，VML需要医学干预。组织工程支架和生物材料构建体被设计用于募集祖细胞和调节免疫微环境。掺入生长因子或干细胞旨在重新引入促生肌信号和结构引导。药理学手段则以纤维化为靶点，例如抑制TGF-β信号，并结合康复锻炼，在临床前模型中显示出令人鼓舞的效果。
5 水凝胶作为骨骼肌再生的平台
水凝胶是亲水的三维聚合物网络，能提供结构支持，同时模拟天然ECM的生化线索以促进生肌和功能恢复。理想的SMTE用水凝胶应具备生物相容性、可生物降解性，其化学和机械性能（如弹性模量）可调以匹配天然骨骼肌（~10–12 kPa），从而促进肌纤维成熟。水凝胶可根据其来源和交联机制，大致分为天然、合成和杂化（复合）系统。
天然水凝胶：来源于胶原、纤维蛋白、明胶、藻酸盐、透明质酸和脱细胞ECM（decellularized ECM, dECM）等生物聚合物。它们生物相容性好，能引发最小的炎症反应，并主动促进肌肉再生。例如，胶原蛋白支架能促进成肌细胞浸润、分化和血管再生；纤维蛋白水凝胶具有固有的促血管生成特性，可支持成肌细胞和内皮细胞共培养，形成排列的肌纤维和内皮网络。然而，天然水凝胶在复制ECM的生化、结构和机械复杂性方面存在不足，且机械强度通常较弱，降解可能过快。
合成水凝胶：由聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）、聚丙烯酰胺（Polyacrylamide, PAAm）、聚己内酯（Poly-ε-caprolactone, PCL）等非生物聚合物工程化制成。其优势在于物理化学性质（如刚度、孔隙率、降解动力学）可精确调控，且重现性好、免疫原性低。尽管缺乏固有的生物活性，但可通过功能化（如接枝短肽）来促进细胞粘附。主要挑战在于细胞粘附较弱，降解副产物可能引发异物反应。
杂化（复合）水凝胶：融合了天然与合成材料的优点，旨在兼具合成聚合物的机械稳健性和天然聚合物的生物活性。这种组合提高了材料的机械强度、生物活性和功能多样性。杂化水凝胶可以呈现为共网络、互穿网络（Interpenetrating Networks, IPNs）等多种结构，并通过点击化学、自组装等方法制备，在组织工程、药物递送等领域展现出巨大潜力。
尽管水凝胶前景广阔，但仍面临挑战：实现充分的血管化和神经支配、免疫相容性、标准化制备方案以及从临床前模型向临床转化的鸿沟。
6 纳米粒子负载水凝胶
为了克服纯水凝胶的局限，研究人员将纳米颗粒（Nanoparticles, NPs）整合到水凝胶基质中，形成纳米复合水凝胶，以递送生物活性信号、增强机械和电学性能、并调节免疫微环境。
聚合物纳米粒子：如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA）、聚多巴胺（Polydopamine, PDA）等，可用于控制药物递送、提供抗氧化支持或机械增强。例如，负载CD146和IGF-1的纳米粒子水凝胶能局部释放促再生蛋白，增强SCs分化并减轻炎症。导电聚合物纳米粒子（如PEDOT）的加入，则能赋予水凝胶导电性，在电刺激下促进肌管排列和生肌分化。
金属纳米粒子：如金（Au）、银（Ag）、氧化铁（Fe3O4）纳米粒子，主要用于引入导电性、机械增强或提供特殊物理引导。金纳米粒子可制造导电支架，增强肌管排列和信号传导；银纳米粒子可提供抗菌性能；磁性氧化铁纳米粒子则能在外加磁场下远程引导支架内部结构的排列，模仿天然肌纤维的平行取向，从而促进生肌分化和排列整齐的肌纤维形成。
脂质基纳米粒子：包括脂质体、固体脂质纳米粒（Solid Lipid Nanoparticles, SLNs）和细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs），作为生物相容性载体，用于控制递送生长因子、核酸或调节蛋白。例如，负载间充质干细胞来源外泌体的水凝胶，可将其携带的microRNA和蛋白质局部递送至损伤部位，持续刺激生肌过程。
碳基纳米粒子：如石墨烯、碳纳米管（Carbon Nanotubes, CNTs），能赋予水凝胶优异的机械强度和导电性。这些导电支架不仅能增强成肌细胞增殖，还能在电刺激下促进肌管收缩。例如，明胶/还原氧化石墨烯（rGO）冷冻凝胶在动物VML模型中显著增强了肌肉再生。
杂化纳米粒子系统：结合了多种纳米粒子的类型，以整合互补特性。例如，将金纳米粒子与聚多巴胺纳米粒子结合，可同时实现抗氧化、抗感染和恢复电信号的功能。或将MXene（Ti3C2Tx）纳米片与甲基丙烯酰化明胶（GelMA）结合用于3D生物打印，制造出具有优异导电性和机械性能的支架。此外，还有微环境响应型（如活性氧ROS响应）纳米复合水凝胶，能够响应病理信号“按需”释放治疗剂。
7 用于组织再生的细胞化水凝胶
细胞化水凝胶是将活细胞封装在旨在模拟天然ECM结构和生化线索的三维聚合物网络内。与传统的二维培养相比，它为细胞提供了更生理相关的微环境，能更好地控制细胞命运和功能。
三维细胞封装与生物模拟：细胞在凝胶前被均匀混入水凝胶前体溶液中，随后通过温度、光或化学交联触发凝胶化，将细胞封装在三维基质中。这种培养方式使细胞能体验到更接近体内组织的相互作用和物理线索。
细胞形态与功能：在水凝胶的三维环境中，细胞表现出与二维培养不同的形态（如球状、簇状），细胞间接触增强，细胞骨架组织也不同，这更接近体内情况。ECM的组成和物理性质通过整合素信号和细胞骨架组织引导基因表达和细胞功能。
保护与机械支持：水凝胶基质能在注射或移植过程中缓冲剪切力，保护细胞免受机械损伤，维持细胞膜完整性，从而提高细胞存活率。其粘弹性和应力松弛特性有助于分散和最小化封装细胞所受的机械负荷。
动态微环境：通过工程化设计，水凝胶可以呈现动态特性。例如，掺入基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases, MMPs）敏感肽段，允许细胞局部降解和重塑基质，支持细胞迁移和铺展。具有可调刚度或粘弹性的水凝胶，能模拟愈合过程中组织力学的时变性变化，动态调控细胞行为。光降解水凝胶则能实现时空可控的局部软化，精确研究细胞对微环境动态变化的感知与适应。
用于骨骼肌组织工程的种子细胞：种子细胞是SMTE的基础，它们作为有生命的构建模块，被引入生物材料支架以启动和调节组织再生。成功的构建体很大程度上取决于细胞与支架及周围微环境的动态相互作用。
- 1.
卫星细胞（SCs）：是负责骨骼肌再生的主要肌肉干细胞，表达Pax7。损伤后，它们被激活、增殖、分化为肌管，修复或再生肌纤维。在水凝胶中培养时，适当的基质能显著增强其生肌分化能力。
- 2.
其他种子细胞：除了SCs，成肌细胞、间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）、内皮细胞等也被用于细胞化水凝胶。在临床前VML模型中，负载肌源性细胞和生长因子的水凝胶（如角蛋白水凝胶、纤维蛋白微丝支架）被证明能改善肌肉质量和力量产生，促进血管化和神经支配，证明了种子细胞在VML生物材料疗法中的关键作用。
