《Nanoscale》：Advances in multivariate analysis of extracellular vesicles using visible light-based analytical methods
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本文系统综述了利用可见光分析方法（如荧光显微镜、流式细胞术、拉曼光谱等）对细胞外囊泡(EV)进行多参数分析的最新进展，旨在解析EV在尺寸、生物分子组成及相互作用等方面的异质性，以克服其在诊断和治疗应用中的关键挑战，推动基于EV的精准医学发展。
引言
从原核到真核细胞，一个有趣的特征是它们能够分泌其膜的一部分，形成纳米尺度（直径数十至数百纳米）的膜包被囊泡。这些囊泡含有脂质、核酸和蛋白质等多种生化成分，在某些方面与其亲本细胞相似，这使其成为有潜力的治疗或诊断剂。这些分泌的囊泡被统称为细胞外囊泡(EV)，根据其起源，可进一步分为微囊泡、外泌体或凋亡小体。其中，外泌体通过一个更明确的亚细胞机制——内体分选转运复合体(ESCRT)途径产生并释放。尽管前景广阔，但EV固有的异质性（如尺寸、载物差异等）为其表征和应用带来了重大挑战。本综述重点探讨了如何利用多种可见光分析方法，同时对EV的多个参数进行分析，以获得对其特性更全面的理解。
光学显微镜方法
显微镜是分析EV的强大工具，因为它能够实现同步可视化和多参数分析。尽管存在衍射极限等挑战，但荧光显微镜及其与原子力显微镜(AFM)等技术的联用，为在单颗粒水平上研究EV的尺寸、刚度及蛋白质共表达等特性提供了可能。例如，Nikoloff等人开发了一种微流控装置，结合四色全内反射荧光(TIRF)显微镜，可同时检测单个EV上的多达四种表面蛋白。他们的研究揭示，在EV上，HER2与CD81的表达呈负相关。另一项研究将AFM与荧光显微镜结合，实现了对单个EV尺寸、刚度及多种跨膜蛋白（如CD9, CD63, CD81）丰度的同步测定，发现表达全部三种跨膜蛋白的EV尺寸更小，凸显了同时分析多个标志物的重要性。
基于微阵列的方法
微阵列技术允许同时对数千个EV进行分析。通常，将特定的捕获探针（如抗体）打印到基底上，以选择性结合目标EV，进而通过荧光或化学发光信号分析其表面标志物。这种高通量方法适用于多元生物标志物检测，但也存在捕获偏差（仅能捕获表达特定表面蛋白的EV）和难以准确表征尺寸等局限。Martel等人开发了一种创新的高通量、多重EV内外蛋白(EVPio)分析方法，通过将抗体与DNA条形码结合并引入互补荧光DNA链进行信号读出，成功检测了EV内外的低丰度蛋白质。类似地，Cawley等人利用纳米接触印刷技术制作了抗体微阵列，用于分析致病菌来源的外膜囊泡(OMV)，以区分是否含有毒素，展示了该技术在细菌感染诊断中的潜力。
表面等离子体共振方法
表面等离子体共振(SPR)是一种无需标记的光学技术，通过测量传感器表面折射率的变化来检测质量吸附，非常适合分析EV与抗体等的相互作用。Yang等人报道了一种结合表面等离子体共振显微镜(SPRM)的平台，可同时检测EV的尺寸分布、浓度和分子结合亲和力。Im课题组开发的纳米等离子体传感器（nPLEX）则利用了金膜中纳米孔阵列的异常光学传输效应，通过检测抗体捕获EV后引起的透射光谱偏移或强度变化，实现了对癌症患者体液中外泌体生物标志物谱的分析。该团队进一步开发了囊泡内纳米等离子体系统(iNPS)，通过使用抗体功能化的金纳米粒子(AuNP)放大信号，成功检测了EV裂解液中的囊泡内蛋白质，检测限低至104个EV，且与ELISA结果有良好相关性。
光散射方法
当光与粒子相互作用时，会发生散射。通过研究散射光，可以了解粒子尺寸、分子量等物理特性。动态光散射(DLS)、纳米颗粒追踪分析(NTA)和静态光散射(SLS)等技术被广泛用于EV表征。DLS通过分析散射光强度的波动来测量布朗运动，从而推算颗粒尺寸；NTA则能实现对单个颗粒的追踪和尺寸分析。Normak等人将液相色谱与多角度光散射(MALS)和荧光检测(FLD)联用，建立了一种集成化方法，可同时表征颗粒浓度、平均直径、蛋白质与颗粒比例、EV表面标志物、脂质组成、EV形状和样品纯度，仅需107个颗粒即可完成全面分析。
流式细胞术方法
流式细胞术是用于EV多变量表征的强有力工具。颗粒在鞘液引导下单个通过激光束，通过测量前向和侧向散射光以及荧光信号，可获取尺寸、内部复杂度和特定生物标志物信息。Sharma等人介绍了一种新型绝缘体介电电泳(iDEP)装置，可根据尺寸和介电特性从细胞培养液中快速分离纳米级EV。纯化后，他们结合成像流式细胞术和miRNA测序进行验证，发现不同来源（血清、血浆、尿液）的EV在CD63和CD81的表达上存在异质性。Von等人开发了“EV指纹识别”方法，结合使用环境敏感膜探针di8，能够在高速（约每分钟10万事件）下分析EV的相对尺寸和膜序特性，并研究EV生物发生中的多个参数，例如敲低Rab27a蛋白会导致膜序EV产量减少。
拉曼光谱方法
拉曼光谱是一种振动光谱技术，通过测量光子非弹性散射的拉曼位移来识别化学基团，具有窄峰宽、水溶液兼容等优点。其信号可通过表面增强拉曼散射(SERS)大幅增强。Lin等人利用包被不同抗体（抗CD63、PD-L1或EGFR）并带有不同拉曼标记分子的金纳米粒子SERS纳米标签，对EV进行表型分析，检测限低至4.46 × 102个EV/mL，并能有效区分来自不同细胞系的EV。为了充分利用SERS光谱的丰富信息，一些研究直接分析EV本身产生的固有SERS信号，并借助机器学习（如主成分分析PCA和线性判别分析LDA）对来自不同细胞（如正常细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞）甚至临床样本的外泌体进行准确分类，还可用于评估化疗药物对癌细胞的影响。
结论与展望
总而言之，尽管EV在诊断和治疗方面潜力巨大，但其固有的异质性仍是临床广泛应用的主要障碍。流式细胞术、显微镜和光学光谱学等分析技术的进步，使得能够同时评估多个参数，从而更全面地研究EV。本综述强调的最新进展表明，在改善EV表征和理解其特性方面已取得显著进步，这对于生物医学应用至关重要。我们讨论了尺寸变异、蛋白质或蛋白质-miRNA复合物之间的相互作用等多种形式的异质性是如何相互关联的，这强调了考虑多参数异质性而非单一参数的重要性。该领域正在通过增强常见台式方法的分析能力而不断发展。最近，人工智能(AI)也被引入EV研究，用于从复杂的生物数据集中预测和识别潜在的EV表面生物标志物，以用于精准药物递送。这些计算策略能够分析大型多维数据集，揭示传统分析方法难以发现的分子模式。展望未来，进一步优化现有方法并开发能够解决当前挑战的新方法，对于推动EV在临床诊断和治疗中的应用至关重要。
