一种集超声波辅助技术在内的深共晶溶剂体系，用于从可可壳中提取抗菌化合物

《RSC Advances》：Integrated sonication-assisted deep eutectic solvent for extraction of antibacterial compounds from cacao shells

　　可可壳的增值利用具有很高的附加价值，这归功于其中丰富的生物活性化合物。本研究探讨了通过绿色提取工艺将可可壳废弃物作为抗菌剂的应用。提取过程结合了SAE-DES（超声波辅助和深共晶溶剂）技术与基于氯化胆碱和乳酸的溶剂。提取参数包括温度、固液比和DES浓度，采用Box–Behnken设计通过响应面方法（RSM）进行优化。最终确定的最佳条件为：温度80°C，固液比1:10，DES浓度为62.65%，总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）分别为每克样品4.94 ± 0.10克GAE和5.97 ± 0.09克RE。此外，质量传递系数（kca）和平衡常数（Hs）的范围分别为8.73 × 10^-3至14.80 × 10^-3 min^-1和0.56 × 10^-3至41.91 × 10^-3克固体/立方厘米。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析证实了提取物中存在显著的酚类化合物功能基团。此外，该提取物对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有抑制作用。

1. 引言
通过增值策略管理农业工业废弃物是支持循环生物经济的重要步骤，因为它可以将生物质废弃物转化为高价值产品。一种丰富但未得到充分利用的农业工业废弃物是可可壳。作为巧克力工业的重要副产品，可可壳约占可可果实生物量的80%。然而，累积的可可壳废弃物通常未经进一步处理就被丢弃，导致环境问题，如产生难闻的气味，并成为害虫和病原体的滋生地，从而显著降低种植园的生产效率。尽管可可壳曾被用作动物饲料，但其利用仍受到可可碱（Theobromine）含量的限制，因为可可碱会影响动物生长并干扰瘤胃微生物活性。因此，需要探索可可壳的其他用途。可可壳含有多种生物活性化合物，包括多酚、黄酮类（儿茶素、槲皮素、表儿茶素）、酚酸（没食子酸、香豆酸和原儿茶酸）以及木质素衍生物。这些化合物具有抗氧化、抗炎和抗菌特性，使其在开发生物降解包装材料、天然食品添加剂和营养保健品方面具有潜在应用价值。然而，由于其复杂的木质纤维素结构，可可壳的提取仍然具有挑战性，这阻碍了溶剂的渗透和质量传递。可可壳由上皮层、中果皮和内果皮组成，构成一个生物聚合物基质。该基质的成分包括纤维素（44.69%）、半纤维素（11.15%）、木质素（34.82%）和果胶（10.10%）。因此，所得化合物的效率和质量极大地依赖于提取方法、溶剂和操作条件。从可可壳中提取酚类化合物通常采用传统技术，如浸渍和索氏提取（Soxhlet extraction），使用乙醇和甲醇等有机溶剂。这些方法存在一些缺点，如提取时间较长、溶剂使用量过多，以及健康和环境风险。工艺的严苛条件可能导致敏感化合物的降解，从而产生生物活性较低的提取物。鉴于这些限制，人们开发了替代的环保提取方法，如PLE（压力液体提取）、SAE（超声波辅助提取）、SFE（超临界流体提取）、EAE（酶辅助提取）、LGE（液气提取）和MAE（微波辅助提取）。这些替代技术被报道可以提高提取效率、减少溶剂使用量并提高重复性。其中，SAE是最有效的方法之一，因为它利用声空化作用破坏坚固的植物细胞基质，从而增加溶剂的渗透和质量传递。然而，SAE的性能受到溶剂类型的影响很大，因此选择合适的溶剂系统是提高生物活性化合物产量的关键因素。一种日益发展的溶剂类型是DES（深共晶溶剂），它由HBA（氢键受体）和HBD（氢键供体）组合而成。DES具有多种优势，如可降解性、无毒性及低挥发性，使其更加环保。此外，基于有机酸的DES被认为具有内在的抗菌活性。然而，其高黏度常常限制了质量传递和提取动力学。将DES与SAE结合使用可以克服这些限制，从而提高化合物的扩散。尽管如此，利用SAE-DES组合从可可壳中提取总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）的应用仍非常有限，这为优化高效、可持续地回收高价值化合物提供了研究机会。此外，达到这些化合物的最高和最优水平具有挑战性，因为溶剂浓度、温度和时间等参数之间存在复杂的相互作用。大多数先前的分析都是分别测试单一因素，未能展示这些变量如何共同影响产量。因此，需要采用响应面方法（RSM）建立数学模型，同时研究这些相互作用，以确保高效、节约资源和高质量的提取过程。

本研究的目的是通过结合SAE-DES方法，最大化从可可壳中提取总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）。为此，应用了带有Box–Behnken设计的RSM来评估温度、固液比和DES浓度的影响。提取物通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行分析，而抗菌效果则通过琼脂孔扩散技术针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行了评估。研究结果为可可壳废弃物的可持续增值利用和开发天然抗菌剂提供了宝贵贡献，有助于在工业中以最少的资源实现最大产量。

2. 材料与方法
2.1 原材料
来自西爪哇Pangandaran可可种植园的可可壳废弃物包含Trinitario（75%）和Forastero（25%）品种。干燥后的壳颗通过实验室研磨机粉碎成细颗粒，然后用Tyler筛网筛选出粒径在-40至+60之间的颗粒。本研究中使用的分析级试剂包括无水乙醇（C2H6O，Supelco，≥99.90%）、无水氢氧化钠（NaOH，Merck，≥99.00%）、无水氯化铝（AlCl3，Merck，≥98.00%）、无水亚硝酸钠（NaNO2，Merck，≥99.90%）、无水没食子酸（Merck，100.00%）、无水芸香苷（Merck，≥96.00%）、无水碳酸钠（Na2CO3，Merck，≥99.90%）、Folin–Ciocalteu试剂（Merck）、氯化胆碱（C5H14ClNO，Himedia，≥99.00%）、无水木质素（Sigma-Aldrich，95.00%）、无水纤维素（Sigma-Aldrich，≥99.90%）、蒸馏水（aquadest）、去离子水（aquabidest）和乳酸（C3H6O3，Himedia，≥90.00%）。
2.2 深共晶溶剂的制备
按照Xia等人的改进方法，以1:2的摩尔比将C5H14ClNO和C3H6O3混合制备深共晶溶剂（DES）。将100克混合物在80°C下以250转/分钟的速度搅拌2小时，直到形成透明、均匀的共晶相。
2.3 提取及质量传递常数的测定
采用超声波辅助提取技术（SAE），使用Elmasonic S30设备对5克干燥的可可壳进行处理。实验条件在40–80°C的温度范围内变化，固液比为1:10–1:45（w/v），DES浓度为50–100%（v/v）。在变化每个参数时，其他变量保持默认值（80°C，1:10 (w/v)，DES浓度为100% (v/v)。具体来说，当温度变化时，固液比和DES浓度分别固定为1:10 (w/v)和100% (v/v)。在提取过程中，每隔一定时间收集样品用于质量传递分析。每个样品提取后用乙醇稀释，然后分析总酚含量（TPC）。质量传递过程理论上分为三个步骤：(1) 酚类化合物从可可壳基质内部扩散到表面；(2) 溶质从表面移动到周围的液膜；(3) 从边界层对流传递到溶剂介质中。在所提出的模型中，对流控制的质量传递机制被认为是最适用的一种。该模型认为，由于颗粒尺寸较小以及提取平衡迅速达成（在3小时内），颗粒内部扩散的速度比界面传递快。
方程（1）基于对流中的Fick定律描述了质量传递，其中NA是从固体到溶剂的生物活性化合物的质量传递速率（g GAE per cm3 min），kca是从固体到溶剂的体积质量传递系数（min^-1），[此处原文似乎缺失了相关数值]，[此处应为]CAf是在固体中与生物活性化合物达到平衡时的生物活性化合物浓度（g GAE per cm3）。平衡方程可以通过以下公式估算：
[此处缺少方程式，无法完整翻译]
其中Hs是平衡常数（g solid per cm3），XA是固体中的生物活性化合物浓度（g GAE per solid）。溶剂中生物活性化合物的质量平衡可以表示为：
[此处缺少方程式，无法完整翻译]
[此处缺少方程式，无法完整翻译]
V是溶剂体积（cm3），固体中生物活性化合物的质量平衡可以根据以下公式表示：
[此处缺少方程式，无法完整翻译]
MS是提取的可可壳固体质量（g solid）。此外，方程（4）和（5）中的初始和边界条件为：
t = 0, CAf = CAf0 = 0, XA = XA0
[此处缺少方程式，无法完整翻译]
t = t × CAf = CAf × XA = XA
[此处缺少方程式，无法完整翻译]
kca和Hs参数根据得到的R2系数（方程（10）进行评估，该系数应较高，接近1。R2系数基于SSE（误差平方和）和SST（平方和总和）获得：
[此处缺少方程式，无法完整翻译]
2.4 使用响应面方法（RSM）进行提取工艺优化
固液提取的优化使用与质量传递实验相同的程序，实验条件基于表1和表2中列出的参数。通过BBD设计（三个水平：-1、0和+1）统计研究了SAE参数对TPC和TFC回收率的影响，详见表1。实验共进行了15次随机试验，包括中心点的三次重复，以确保模型的准确性和重复性，详见表2。每次提取在实验设计规定的具体操作条件下进行2.5小时。提取后，混合物在4000转/分钟的速度下离心10分钟，以分离上清液和固体残留物。收集上清液和固体残留物并进行分析。表1

SAE-DES提取过程中变量的变化以及Box–Behnken设计的编码水平

自变量
符号
编码水平

?1
0
1

温度（°C）
x1
40
60
80

固体与溶剂的比例
x2
1：10
1：25
1：40

DES浓度（百分比，以水中的DES计）
x3
25
50
75

表2

Box–Behnken设计的矩阵，包括观测到的响应值和预测误差

试验次数
变量
总酚含量（g GAE/g样品）
总黄酮含量（g RE/g样品）

1
0
0
0
1.70 ± 0.08
1.82
2.41 ± 0.05
2.62

2
0
0
0
1.82 ± 0.04
1.82
2.65 ± 0.13
2.62

3
0
?1
?1
3.04 ± 0.16
3.08
3.92 ± 0.29
3.81

4
?1
0
?1
1.01 ± 0.03
1.01
2.13 ± 0.02
2.17

5
+1
+1
0
1.39 ± 0.02
1.42
2.08 ± 0.08
2.01

6
+1
0
+1
2.30 ± 0.01
2.30
2.51 ± 0.17
2.60

7
?1
0
+1
1.14 ± 0.01
0.98
1.82 ± 0.01
2.46

8
0
0
0
1.94 ± 0.09
1.82
2.79 ± 0.05
2.62

9
?1
?1
0
2.77 ± 0.01
2.73
4.51 ± 0.02

10
0
+1
?1
0.98 ± 0.07
0.79
1.66 ± 0.04
1.68

11
+1
?1
0
4.44 ± 0.08
4.25
5.52 ± 0.07
5.58

12
+1
0
?1
1.64 ± 0.03
1.80
2.24 ± 0.04
2.29

13
0
+1
+1
0.97 ± 0.01
0.94
1.28 ± 0.04
1.39

14
?1
+1
0
0.64 ± 0.03
0.83
2.79 ± 0.04
2.73

15
0
?1
+1
3.19 ± 0.04
0.94
4.71 ± 0.21

RSM分析了主要效应、交互作用和二次项，这些随后被纳入回归模型中以得出预测方程（公式（11）。

其中Y是预测响应值（TPC和TFC回收率），x1、x2……xk代表影响提取效率的SAE-DES因素，β0是截距项。系数βi（i = 1, 2……k）代表线性效应，βii（i = 1, 2……k）代表二次效应，βij（i = 1, 2……k；j = 1, 2, 3……k；j ≠ i）代表交互效应。最后，ε是随机误差项。TPC和TFC被记录为响应变量。通过应用期望函数进行优化，以找到产生最大TPC和TFC的提取条件。为了验证模型的预测性能，在最佳条件下重复了3次提取过程，并将实验数据与95%预测区间（PI Low和PI High）进行了比较。

2.5

TPC和TFC的测定

提取物的TPC是通过UV-Vis分光光度计，遵循Folin–Ciocalteu比色技术测定的，该方法有所改进，如Singleton等人所述。将0.3毫升提取物与2.5毫升十倍稀释的Folin–Ciocalteu试剂（v/v）混合，并加入2.0毫升碳酸钠（7.5% w/v）。反应混合物在室温下避光条件下孵育2小时。在760纳米处测量吸光度，以没食子酸作为校准标准。结果以每克样品中的没食子酸当量（g GAE/g样品）表示，并进行两次重复实验。TFC是根据Blasa等人和Rodríguez-Martínez等人的方法，通过氯化铝比色法测定的。将1毫升每种提取物分别与0.3毫升亚硝酸钠溶液（5% w/v）和0.3毫升氯化铝溶液（10% w/v）反应。在室温下孵育3分钟后，使用UV-Vis分光光度计在510纳米处测量吸光度。以黄酮苷为参比化合物，结果以每克样品中的黄酮苷当量（g RE/g样品）表示。所有测定都进行了两次重复。

2.6

使用FTIR对功能基团进行表征

使用Thermo Scientific Nicolet iS10 FTIR光谱仪在600–4000 cm?1的波数范围内分析提取物的功能基团，分辨率约为8 cm?1。将大约1至2毫克的干燥样品与100毫克的KBr（溴化钾）粉末一起放入混合器中，并用液压压机压缩成透明的KBr颗粒。为了最小化光谱干扰，使用KBr颗粒方法来确保功能基团的正确鉴定。对于液体样品，如可可壳提取物，使用装有ATR（衰减全反射）附件的FTIR光谱仪进行分析。将几滴液体提取物滴在ATR晶片的干净表面上。通过彻底用乙醇干燥ATR晶体来分离测量结果，以避免样品污染。通过建立功能基团的典型吸收带来观察获得的光谱。

2.7

TGA（热重分析）

进行TGA以确定可可壳提取物的热稳定性和成分变化。评估是在PerkinElmer TGA 40000上进行的。为了避免氧化降解，将大约5–10毫克的样品在氮气存在下以10 °C min?1的线性温度从30°C加热到600°C。随后，利用热重图来识别水分损失、热分解阶段以及热稳定成分的存在。

2.8

SEM（扫描电子显微镜）

进行SEM以观察可可壳提取物残留物的表面形态。在分析之前，样品被镀上一层碳（C）薄层以增强导电性。镀层样品放置在SEM样品台上，并使用JEOL JSM-6510LV在15 kV的加速电压下进行观察。获得的显微图像提供了关于提取后样品表面结构变化的宝贵信息。

2.9

抗菌活性测定

测试了样品对大肠杆菌（ATCC 25922）和金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）的抗菌活性。最初，将细菌菌株培养在NA（营养琼脂）平板上，并在35 ± 1 °C下孵育18–24小时。单个菌落转移到无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并稀释至1 × 10^8 CFU mL?1，光学密度约为0.1，在550纳米处，相当于0.5 McFarland标准。应用琼脂孔扩散技术来测定抗菌活性。最初，将1毫升标准化的细菌悬浮液均匀分布在无菌Petri皿中。预先在45 ± 1 °C下平衡的Mueller-Hinton琼脂（MHA）以恒定体积（20 mL）倒入每个Petri皿中，确保所有平板的均匀分布。琼脂固化后，使用无菌锥zure小心地制作直径为6毫米的孔，每个孔填充20 μL的测试溶液。阳性和阴性对照分别为10 mg mL?1的甲氧苄啶和无菌蒸馏水。随后，将平板在37 °C下孵育24小时，以达到相同的条件。通过测量孔周围的抑制区直径来获得抗菌活性。每个测定都进行了三次重复，以确保可重复性。

2.10

统计分析

使用Design-Expert软件版本13（Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, USA）通过RSM-BBD进行了TPC和TFC提取优化。在p < 0.05的显著性水平下进行ANOVA（方差分析），以评估各个因素及其相互作用的影响。通过将实验结果与95%预测区间（PI Low-PI High）中预测的结果进行比较来检查模型的适当性。抗菌活性、对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制区直径、TPC和TFC值使用Statgraphics Centurion版本18（Statgraphics Technologies, The Plains, VA, USA）进行了统计分析。数据以重复测量的平均值±标准差（SD）表示。在确定处理之间的显著差异（p < 0.05）时，进行了单因素ANOVA，随后进行了Tukey的事后检验。使用不同的上标字母来表示统计上的显著差异。

3.1

质量转移提取对可可壳提取物中黄酮含量的影响

理解固液提取过程中的质量转移对于最大化生物活性化合物的回收至关重要。几个参数影响SAE-DES过程中化合物的质量转移。溶剂组成、固体与溶剂的比例、温度和提取周期影响提取速率和产量。在这项可可壳提取研究中，质量转移是通过TFC来更具体地衡量的，TFC反映了黄酮化合物的转移情况，而不是TPC。这样做是因为可可壳含有高水平的黄酮，使它们更具代表性，并允许更准确地评估质量转移效率。使用TFC作为标记来测定质量转移效率。这种方法提供了关于提取参数对生物活性产量影响的关键见解，以指导可持续和可扩展提取过程的发展。

本研究测试了三个参数，即温度、固体与溶剂的比例以及DES的浓度，并在特定时间间隔收集样品。提取参数对从可可壳中提取TFC的质量转移系数（kca）和平衡常数（Hs）有显著影响，如表3所示。理论上，温度的升高会增加质量转移。然而，在这项分析中观察到的情况相反，因为在80 °C时提取物显示出最高的TFC浓度，其质量转移系数（kca）为8.88 × 10^3 min?1，低于其他两个数据点。同时，提取物显示出较高的平衡常数9.33 × 10^3 g solid per cm^3，这增加了质量转移的驱动力并产生了更高的TFC。在80 °C时TFC的巨大产量增加可以归因于溶质扩散的增强和植物基质的膨胀，增加了溶剂渗透的表面积。这与在较低温度下获得的产量相比提供了更高的生物活性提取物产量。表3显示了提取变量对质量转移和平衡行为的影响。

参数
温度（°C）
40
60
80

kca (min?1)
14.80 × 10^?3
12.53 × 10^?3
8.88 × 10^?3

Hs (g solid per cm3)
1.59 × 10^?3
3.98 × 10^?3
9.33 × 10^?3

R2
0.79
0.88
0.95

误差 (%)
0.10
0.29
0.64

参数
固体与溶剂的比例
1：10
1：25
1：40

kca (min?1)
8.73 × 10^?3
9.89 × 10^?3
11.16 × 10^?3

Hs (g solid per cm3)
41.91 × 10^?3
10.79 × 10^?3
0.56 × 10^?3

R2
0.95
0.91
0.89

误差 (%)
9.19
1.35
0.24

参数
DES浓度（%）
50
75
100

kca (min?1)
12.93 × 10^?3
12.08 × 10^?3
8.88 × 10^?3

Hs (g solid per cm3)
13.89 × 10^?3
10.36 × 10^?3
9.33 × 10^?3

R2
0.98
0.97
0.95

误差 (%)
0.54
0.42

根据表3中的数据拟合，固体与溶剂的比例影响质量转移和平衡常数。在较低的比例下，溶剂的可用性丰富，从而提高了提取速率。如表3所示，固体与溶剂的比例为1：40产生了最高的质量转移率常数（11.16 × 10^?3 min?1）。然而，在较低的比例下，所得到的平衡常数（Hs）低于其他数据。这是由于系统中固体含量低，限制了溶剂在固体周围的可用性，导致TFC产量较低。除了温度和固体与液体比例外，DES浓度也影响kca和Hs的值。DES浓度的增加会导致粘度提高，这可能会阻碍扩散和溶剂的渗透。因此，质量转移速率降低，因为在100%浓度下计算出的kca值（8.88 × 10^?3 min?1）低于其他数据。除了导致粘度降低外，浓度的减少还可能导致高导电性，从而提高质量转移速率。在测试的DES浓度变化中，50% DES显示出物理化学性质的最佳平衡，具有较高的kca（12.93 × 10^?3 min?1）和Hs（13.89 × 10^?3 g solids per cm^3）值。这些结果表明，为了实现有效的溶剂系统并保持足够的溶解度以提取黄酮类化合物，需要对DES进行部分水化处理。37

尽管表3提供了质量传递参数的定量概述，但通过图1所示的质量传递曲线可以更深入地理解提取动力学。图1(a)显示了温度和提取时间对TFC（总提取量）的影响。如图所示，TFC随着温度的升高而增加。在80°C、60°C和40°C的平衡条件下，TFC值分别为9.33 × 10^-3克固体/立方厘米、3.98 × 10^-3克固体/立方厘米和1.59 × 10^-3克固体/立方厘米。基于这一发现，温度的升高导致平衡常数的增加，表明该过程是吸热的。在从可可壳和其他植物中提取多酚时也报告了类似的趋势，其中生物活性提取物的产量随着温度的升高和使用超声波提取方法而增加38,39。此外，图1(b)还展示了固体与溶剂比例和提取时间对TFC的影响。在1:10的比例下获得了最高的TFC值，而随着比例的进一步降低，TFC值下降。在平衡条件下，最低的TFC值出现在1:40的比例下，为0.56 × 10^-3克固体/立方厘米。

在不同条件下SAE-DES的TPC（总酚含量）：(a)提取温度，(b)固体与溶剂的比例，以及(c)DES浓度。数值代表平均值±标准差（n=2）。如图1(c)所示，DES浓度的变化也会影响TFC的结果。根据图表，DES浓度的增加会导致TFC的减少。最佳条件出现在DES浓度为50%时，平衡产量为13.89 × 10^-3克RE（总酚）/立方厘米。这个值高于75%和100%溶剂浓度下的产量，其TFC产量分别为10.36 × 10^-3克RE/立方厘米和9.33 × 10^-3克RE/立方厘米。这种减少受到溶剂物理化学性质的影响，较高的DES浓度会导致粘度增加。在这些条件下，溶剂在可可壳基质中的渗透和质量传递可能会受到阻碍。40

3.2

提取条件的优化

在对SAE-DES提取过程的质量传递和平衡常数参数效应进行研究后，进行了优化分析。多变量分析显示，二次模型对TPC（总酚含量）和TFC（总提取量）具有统计学上显著的p值（p < 0.05），证实了其预测响应的适用性（见表S1）。从ANOVA分析结果（表4）来看，两个模型的F值都很高，分别为TPC的34.97和TFC的66.83。这表明所使用的模型在统计上是显著的。这一点通过每个模型的p值< 0.05得到了加强，证实了选定的自变量及其相互作用通常会影响响应。此外，缺乏拟合的分析结果显示，TPC的p值为0.178，TFC的p值为0.588。这表明缺乏拟合并不显著，从而提高了模型的准确性。除了传统的统计指标（如R2和p值）外，图S1中实验值与TPC和TFC预测值之间的强关系也证实了模型的预测能力。结果显示数据点集中在恒等线周围，表明预测误差低，同时模型的稳健性和对过程优化的实用性也很强。表4

ANOVA和拟合统计量

来源
总酚含量（RGE）
总黄酮含量（RE）

SS
MS
F值
p值
SS
MS
F值
p值

模型
15.13
1.68
34.97
0.001
20.67
2.30
66.83
0.000

线性
x1
2.22
2.22
46.21
0.001
0.00
0.00
0.02
0.906

x2
11.18
11.18
232.61
0.000
14.72
14.72
428.28
0.000

x3
0.10
0.10
2.18
0.200
0.04
0.04
1.24
0.316

二次
x12
0.00
0.00
0.02
0.891
0.18
0.18
5.38
0.068

x22
0.95
0.95
19.77
0.007
2.89
2.89
84.03

x32
0.29
0.29
6.02
0.058
1.37
1.37
40.00

交互作用
x1
0.21
0.21
4.42
0.089
0.73
0.73
21.25
0.006

x2
0.07
0.07
1.47
0.279
0.08
0.08
2.41
0.181

x3
0.01
0.00
0.12
0.740
0.34
0.34
10.02
0.025

缺乏拟合
0.21
0.07
4.78
0.178
0.09
0.03
0.83
0.588

R2
0.9844

0.9918

0.9562

0.9769

使用RSM（响应面法）对使用DES恢复TPC和TFC的操作条件进行了统计优化。优化了多个参数，包括温度、固体和溶剂比例以及DES浓度。使用主效应图进一步检验了每个参数的影响，如图S2所示。这些图显示了独立变量（温度、固体/溶剂比例和DES浓度）与因变量（TPC和TFC）之间的变化。此外，多变量分析（标准化帕累托图，图S3）显示了各个因素及其相互作用对TPC和TFC的重要性和方向性。根据结果，显著的交互作用进一步证实了提取变量的复杂相互依赖性。如图2所示，提供了三维图来直观识别每个参数对响应的影响。构建了一个包含线性、交互作用和二次项的回归模型，以全面描述过程参数与响应变量之间的多因素相关性。这些模型解释了温度、溶剂与样品比例以及DES浓度对TPC和TFC产量的影响。加入交互作用和曲线项提高了模型准确表示实际实验行为的能力，从而提高了过程优化的预测能力。最终的回归方程如下所示。TPC = 1.64 + 0.0372x1 ? 0.1403x2 + 0.0360x3 ? 0.000041x12 + 0.002255x22 ? 0.000448x32 ? 0.000769x1x2 + 0.000266x1x3 ? 0.000103 x2x3

TFC = 2.81 ? 0.0176x1 ? 0.1624x2 + 0.1374x3 + 0.000560x12 + 0.003931x22 ? 0.000976x32 ? 0.001424x1x2 ? 0.000288x1x3 ? 0.000782x2x3

x1、x2和x3代表SAE-DES因素（温度（x1）、固体与溶剂的比例（x2）以及DES浓度（x3）。

响应曲面3D显示了SAE-DES因素对可可壳提取物中TPC（总酚含量）(a)和TFC（总提取量）(b)水平的影响。从这项研究获得的响应曲面图在设计空间的角落而不是中心点是最优的。根据图2(a)，随着温度的升高和固体与溶剂比例的降低，酚类产物的产量持续增加。这是由于质量传递的增强以及超声波处理和DES处理过程中的脱木质化反应的共同作用。在高温下，分子扩散系数增加，从而减少了通过植物细胞壁的质量传递阻力。同时，由氯化胆碱和乳酸组成的DES通过氢键作用和温和的酸水解破坏木质素结构，导致部分脱木质化。这可以增加孔隙度并削弱纤维素-木质素基质，从而增加溶剂对细胞内酚类化合物的接触。这些发现与之前使用RSM优化方法和乙醇作为溶剂的研究结果有显著差异42。在那项研究中，最大TPC仅为0.26克GAE每样品，而在这项研究中达到了4.44克GAE每样品。这种显著差异被认为是由于乙醇在破坏可可壳中的木质纤维素基质，特别是木质素方面的能力有限，导致酚类化合物的释放不理想。此外，在低溶剂与溶质比例下，溶剂的溶解和传输更为高效。这种条件可以减少浓度梯度并防止局部饱和。为了加强这一分析的结果，进行了TGA（热重分析）和SEM（扫描电子显微镜）测试。优化过程旨在在考虑可行性和操作效率的同时最大化TPC和TFC的产量。在本次优化中测试了三个参数：大约40°C和80°C的温度，1:10到1:40的固体与溶剂比例，以及25–75%的DES浓度。采用期望函数方法进行了优化，将TPC和TFC两个响应赋予了最高重要性级别（+++++）。最佳条件出现在80°C、固体与溶剂比例为1:10以及DES浓度为62.65%时。在这种条件下，模型预测的总体期望值为0.982，显示出两个目标响应之间的良好平衡。接近1的期望值表示预测精度很高。在这项研究中，略低的期望值反映了在最大化TPC和TFC之间的折中，其中较高的DES浓度倾向于增强TPC的提取。相反，较低的浓度更适合最大化TFC。为了验证优化结果，在最佳条件下进行了三次计算。实验结果与预测结果的比较显示在表5中。平均TPC和TFC值分别为4.94 ± 0.10克GAE每克样品和5.97 ± 0.09克RE每克样品。这些值非常接近预测模型值（分别为4.32和5.46），并且都在95%的预测区间内，从而证实了所获得回归模型的可靠性和准确性。表5

在最佳条件下预测值和实验值的验证

分析
预测平均值
预测中位数
标准差
n
95%预测区间下限
数据平均值
95%预测区间上限

TPC
4.32
4.32
0.22
3
3.71
4.94
4.94

TFC
5.46
5.46
0.19
3
4.94
5.97

3.3

FTIR分析和可可壳提取物及残留物的表征

FTIR光谱用于分析在不同温度和提取时间下SAE-DES提取后可可壳残留物的结构变化和功能基团演变（图3）。该分析提供了关于DES系统对酚类化合物、黄酮类、多糖和木质素衍生结构的提取选择性和相互作用机制的见解。在高波数区域（3600–3200 cm^-1），所有样品都显示出一个宽吸收带，对应于与含羟基和氨基的生物活性化合物（包括酚类、黄酮类和水溶性多糖）相关的–OH和–NH伸缩振动。44–46 在较高温度和较长提取时间下，吸收强度有所下降。这表明亲水成分显著丢失。在3272–3300 cm^-1附近的峰强度逐渐减小，表明由于与DES成分的强氢键作用，亲水成分和羟基含量减少。结果与Wang等人的研究47一致，他们在植物基质提取过程中观察到了类似的光谱趋势。图3

在不同提取温度（a）和时间（b）下，可可壳残留物的傅里叶变换红外（FTIR）光谱。同时，在所有样品的FTIR结果中观察到了2920–2850 cm^-1处的–CH伸缩振动。这表明存在脂肪链、甲基和亚甲基，这些通常存在于木质素、脂质或蜡质成分中。这表明随着提取温度和时间的增加，峰强度适度减小。–CH基团的减弱，尤其是在360分钟时，表明由于长时间的超声处理，脂肪基团部分溶解或破坏。此外，1740–1600 cm^-1范围内的光谱特征表明羰基和芳香化合物的吸收。在1738–1732 cm^-1处观察到的CO伸缩带与酯化酚类化合物或木质素衍生物相关。数据显示，在提取后强度减小，并且向较低波数略微移动。这表明成功提取了富含黄酮的骨架和芳香化合物。然而，即使在360分钟的提取后，仍能检测到一些这些带。这表明存在 lignin 结构，这些结构能够抵抗完全溶解，正如 Giummarella 和 Lawoko (2017) 所解释的。49

在指纹区域（1400–1000 cm?1），观察到 C–O 和 C–O–C 拉伸带的明显减少，这些特征表明了多糖和酚醚的存在，反映了可溶性碳水化合物和醚键连接的酚类物质的去除。50,51 在提取后的残留物中出现新的带状谱线，以及 1000 cm?1 以下的信号减弱，进一步表明了可可壳基质的结构重排和降解。这很可能是由于可可壳基质的结构分解和逐渐受损。除了提取残留物的光谱外，图 3 还展示了纯 lignin 和纤维素的参考光谱。所有残留物光谱与纤维素的相似度更高，这表明在提取过程中，一些 lignin 化合物和酚类化合物倾向于从固相溶解并迁移到溶剂中，留下富含纤维素的固相部分。总体而言，这些 FTIR 结果证实，提高提取温度和时间有助于增强生物活性化合物的释放，特别是那些来自酚类和 lignin 组分的化合物，而更具抗性的 lignocellulosic 结构，尤其是纤维素，仍然留在固相残留物中。图 4 中的 DES 光谱显示了氢键供体（乳酸）和氢键受体（氯化胆碱）的特征吸收峰，以及 –OH 和 –NH 拉伸带的宽化和合并（约 3296 cm?1）。这表明了强烈的氢键相互作用。加入可可壳提取物后，–OH 峰变得更加强烈。这种情况表明从基质中成功提取出了富含羟基的植物成分。一些先前的研究也发现了可可壳中的黄酮类植物成分槲皮素。52,53 槲皮素结构在 C-3、C-5、C-7、C-3′ 和 C-4′ 位置含有大量的羟基，这与提取光谱中 –OH 峰的增加直接相关。54 除了羟基之外，提取物-DES 混合物中在 1731 cm?1 和 1646 cm?1 处出现的新峰与 CO 拉伸和芳香族 CC 振动有关，表明存在富含羰基和芳香族的化合物，这与报道的槲皮素的振动模式一致。使用拉曼光谱进行的先前研究也支持了多种生物活性化合物的存在，其中之一就是黄酮类化合物槲皮素。45 尽管这些光谱特征与槲皮素非常相似，但 FTIR 光谱中振动带的重叠表明提取物中可能还存在其他结构相关的多酚类或芳香族化合物。图 4

FTIR 光谱显示了单个组分（氯化胆碱和乳酸）、合成的深度共晶溶剂（DES；ChCl?:?LA）以及使用 DES 提取的可可壳提取物的特征。

3.4 可可壳的热重分析

为了评估可可壳在溶剂辅助的共晶超声波处理（SAE-DES）提取前后的热稳定性和组成变化，进行了热重分析（TGA）。总共分析了两个样品，分别在 40 和 80 °C 下进行，结果显示在图 5 中。根据 TGA 曲线，每个样品的残余生物质显示出三个阶段的热分解模式。在第一阶段，直到 130 °C，所有样品的质量都有轻微损失，这与物理吸附和结合的水的蒸发有关。这个阶段与自由水解吸和弱结合的纤维内水分子有关，正如之前在 lignocellulosic 生物质中报道的那样。55

图 5 显示了在 40 °C 和 80 °C 下提取的可可壳和 DES 残余物的热重分析（TGA）曲线。在降解的第二阶段（200 至 350 °C），大量的质量损失与半纤维素（220–315 °C）和纤维素（300–400 °C）的解聚和挥发有关。56 未经处理的可可壳具有更宽的降解肩部，表明其结构更加无序。而 SAE-DES 干燥后的残留物，尤其是在 80 °C 下提取的样本，具有更薄、更紧密的降解轮廓，表明结构简化。80 °C 残余物的较低最大分解温度表明其热稳定性较低，因为热稳定组分（包括 lignin 和缩合酚类）的去除增加。57

在最后的降解阶段，温度超过 350 °C，热降解与 lignin 和其他抗性芳香结构 的缓慢碳化过程有关。由于 lignin 的复杂和交联结构，其降解范围很广（150–900 °C）。在图 5 中，SAE-DES 80 °C 残余物的残余质量比其他样品少。这表明该样品的脱木质化程度高于 SAE-DES 40 °C 残余物和未经处理的样品。这种模式与相应提取物中记录的更高 TPC 值正相关，表明在高温提取过程中 lignin 衍生酚类物质的释放更为有效。总体而言，TGA 分析的结果显示了 SAE-DES 提取导致可可壳生物质的结构变化。这种热行为表明，较高的提取温度有利于酚类和 lignin 组分的释放，从而留下更容易受到热降解的残留物。

3.5 提取前后可可壳的 SEM 特性分析

经过综合 SAE-DES 处理的可可壳样品在 SEM 上进行了观察，以研究其在不同温度和提取时间下的结构变化。图 6 显示了在 (a) 40 °C 和 80 °C 以及 (b) 90 分钟和 360 分钟提取的样品的 SEM 结果。未经提取的可可壳生物质显示出光滑、密集且连续的表面，具有块状特征，反映了由 lignin、半纤维素和果胶组成的完整 lignocellulosic 细胞壁。这些细胞壁的组分结合了纤维的基质，阻碍了细胞内生物活性化合物（如酚类化合物）的释放。58,59

图 6 显示了在 (a) 温度（40 和 80 °C）和 (b) 提取时间（90 和 360 分钟）影响下提取残留物结构变化的光谱扫描（SEM）分析。在图 6(a) 中，高温（80 °C）提取后，细胞壁结构中观察到了较大的孔隙和空洞，而 40 °C 提取时则相对较少。这种孔隙率的增加归因于高温下的脱木质化过程。这一结果得到了热重分析（TGA）的证实，该分析显示了显著的 lignin 降解。60 脱木质化过程导致 lignin-碳水化合物复合物的断裂，从而削弱了细胞壁结构，使溶剂能够渗透。因此，形成了更大的孔隙，提高了溶剂的可及性和扩散路径，促进了酚类化合物从固体基质向溶剂的迁移。SEM 结果还表明，在 maximum 测试温度下，脱木质化过程仍在继续。这一发现与 TGA 结果一致，后者显示 lignin 在 80 °C 以上的温度下继续降解。这种持续的降解归因于高温，这会增加脱木质化过程和溶剂与基质之间的接触。这种相互作用预计会提高提取效率，优于本研究记录的效果。DES 和 SAE 引起的空化共同作用对细胞壁的不稳定性有显著影响。具体来说，超声波处理由于压力在压缩和膨胀阶段之间的快速变化而产生微气泡。这些气泡破裂时释放机械剪切力，能够破坏植物组织。这一过程被称为空化，使得 DES 能够渗透植物组织并溶解 lignin。 lignin 的溶解取决于偶极-偶极相互作用和氢键作用。62 这两种效应共同作用，溶解了细胞壁组分和 lignin 的生物活性化合物。可可壳的残留物在 90 分钟和 360 分钟后进行提取，图 6(b) 显示了差异。使用更长时间的 SAE-DES 方法提取的 SEM 结果显示了纤维断裂和组织塌陷。这些变化表明细胞壁逐渐分解，这与脱木质化过程一致。这促进了质量传递的增加和细胞内化合物的更大幅度释放。这一发现得到了相关研究中动力学和扩散分析的支持，这些研究报道了基于 DES 的系统中更高的 Biot 数值和有效扩散系数。Lee 等人的研究63证明了酚类化合物从生物质到溶剂的快速质量传递过程，这归因于超声波引起的湍流和 DES 的强溶解能力。

3.6 可可壳提取物的抗菌分析

使用 SAE-DES 提取的可可壳提取物被测试了其抗菌活性。评估是针对革兰氏阴性细菌（E. coli ATCC 25,922）和革兰氏阳性细菌（S. aureus）进行的，采用了琼脂孔扩散法。针对 E. coli 的测试是在 80 °C 下提取 90、150、180 和 360 分钟后进行的，如表 6 所列。为了比较提取物的效果，也对单一 DES 溶剂和阳性对照（Trimethoprim）进行了测试。对于所有测试的时间段，E. coli 的抑制区通常都相当大。这表明其具有很强的杀菌潜力。表 6显示了 TPC 和 TFC 对 E. coli 抗菌测试结果的影响

代码
温度（°C）
提取时间（分钟）
TPC（每克样品的 gallic acid 当量）
TFC（每克样品的 rutin 当量）
抑制区（毫米）

DES-1
80
90
0.24 ± 0.00
0.07 ± 0.01
27.67 ± 2.08b

DES-2
80
150
0.49 ± 0.00
0.16 ± 0.00
30.33 ± 1.04 ab

DES-3
80
180
0.65 ± 0.00
0.11 ± 0.00
33.33 ± 0.21 ab

DES-4
80
360
1.35 ± 0.01
0.15 ± 0.02
27.33 ± 0.58b

DES（ChCl?:?LA）
24.33 ± 2.03a

阳性对照
39.67 ± 3.95b

a
平均值 ± 标准差；n = 3；GAE = gallic acid 当量；RE = rutin 当量。在提取物中观察到了最高的抗菌活性，抑制区直径为 33.33 ± 0.21 mm，与阳性对照（39.67 ± 3.95 mm，p > 0.05）统计上相当。这一结果来自提取时间为 180 分钟的样品。这种可可壳提取物对 E. coli 的强烈抑制作用可以归因于提取物中存在的酚类化合物、黄酮类和有机酸产生的多种协同抗菌机制。这一过程中有四种可能性。首先，这些生物活性化合物抑制了细菌的外排泵，从而阻止了有毒物质的释放，并增强了细胞内抗菌剂的积累。其次，黄酮类还与细菌的核糖体相互作用，抑制了蛋白质的产生并干扰了重要的代谢过程。第三，多酚类防止了 DNA 旋转酶的活性，缠结 DNA 并干扰了复制过程。第四，两亲性酚类化合物和有机酸有能力破坏细菌细胞膜，导致细胞质泄漏和细胞活力丧失。64,65

根据表 6 中的数据，尽管 TPC 较高，但提取时间为 360 分钟的样品的抑制区直径有所下降。这种减少是由于热稳定的抗菌剂（如槲皮素、儿茶素和其他黄酮类）的热降解，或者结构变化降低了生物利用度和膜通透性。66

单独使用 DES 溶剂（ChCl?:?LA）也显示出相对较高的抗菌活性（24.33 ± 2.03 mm）。这一发现支持了先前的研究，即含有有机酸的天然深度共晶溶剂（NaDES）由于其低 pH 值（1.28 ± 0.25）和能够使微生物细胞膜变性而具有内在的抗菌特性。67 另一项研究报道，使用传统乙醇提取的可可壳提取物对 E. coli 的抑制区为 5.26 ± 0.71 mm。有趣的是，使用 SAE-DES 方法提取产生的抑制区可以生成更大的抑制区。这证实了氯化胆碱和乳酸结合超声处理时的协同效应，从而显著提高了酚类化合物的产量。提取物的抗菌特性也在 S. aureus 上进行了测试，如表 7 所示。对最佳可可壳提取物的分析结果显示出 28.83 ± 0.76 mm 的抑制区。该值大于三甲氧苄胺（阳性对照）的值，三甲氧苄胺的抑制区为22.67 ± 0.29毫米（p < 0.05）。这证实了使用SAE-DES方法提取的可可壳提取物具有很强的杀菌效果。根据álvarez-Martínez等人68年的研究，富含多酚的植物提取物对革兰氏阳性细菌表现出更强的抑制活性。这是因为革兰氏阳性细菌的肽聚糖层虽然厚但多孔，允许小分子抗菌剂穿透，而革兰氏阴性细菌的外层脂多糖层则起到屏障作用。表7显示了最佳可可壳提取物的抗菌能力。

然而，在本研究中，可可壳提取物对大肠杆菌的抑制作用比对金黄色葡萄球菌的抑制作用更强，这与之前的研究结果相反。这一不寻常的结果是由于可可壳独特的酚类和黄酮类成分所致。低分子量亲水性酚类化合物以及丰富的有机酸被认为能够穿透革兰氏阴性细菌的孔通道，从而破坏其细胞膜的完整性。此外，使用DES方法提取可以使小分子极性生物活性化合物的回收率增加，因为该方法改变了这些化合物的电离状态，从而提高了它们穿过革兰氏阴性细菌外膜的通透性。酸性DES环境（pH 1.28）与多酚类化合物之间的协同作用也可以通过酸应激和氧化损伤进一步削弱大肠杆菌的细胞壁，这解释了观察到的显著抑制效果。

结论

本研究展示了DES（ChCl：LA）从可可壳废物中提取生物活性化合物的潜力。温度、固液比和DES浓度会显著影响提取的生物活性化合物的含量，这通过TPC（总酚含量）和TFC（总黄酮含量）分析得到了证实。该过程记录的质量传递系数（kca）和平衡常数（Hs）范围分别为8.73 × 10^-3至14.80 × 10^-3 min^-1以及0.56 × 10^-3至41.91 × 10^-3 g solid per cm^3。通过BBD（ Box-Behnken设计）进行的RSM（响应面设计）优化表明，最佳操作条件为80°C、固液比为1:10以及DES浓度为62.65%，在这些条件下获得了生物活性化合物含量最高的提取物。FTIR光谱分析确认了提取物中确实存在生物活性化合物，并且这些化合物通过抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长显示出潜在的抗菌作用。

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或可能影响本文工作的个人关系。

支持本研究发现的数据可在文章及其补充信息（SI）中找到。如需更多与本研究相关的数据，可向相应作者提出合理请求。补充信息包括统计验证模型的适用性、回归模型对TPC和TFC响应的预测性能、单个提取参数（提取时间、温度和DES浓度）对总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）的影响，以及UAE变量对提取物中TPC和TFC水平的主效应、交互效应和二次效应。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ra01724j。

作者感谢印度尼西亚教育发展基金（LPDP）通过印度尼西亚-NTU新加坡可持续性与创新研究所（INSPIRASI）（编号：6636/E3/KL.02.02/2023）提供的财务支持。