《Journal of the Indian Chemical Society》：Forced degradation study and impurity profiling of erlotinib hydrochloride using RP-HPLC and orbitrap LC-HRMS analysis and their in silico toxicity assessment
编辑推荐：
研究开发Erlotinib Hydrochloride（ERL）-PLGA系统的RP-HPLC定量方法，并开展其强制降解试验，通过LC-HRMS鉴定14种降解产物及杂质，评估毒性及环境可持续性，为药物递送系统优化提供依据。
阿努莫尔·约瑟夫（Anumol Joseph）、赛迪库尔·阿克巴尔（Sideequl Akbar）、阿达尔什·马尔加维（Adarsh Malgave）、鲁图贾·苏里亚万希（Rutuja Suryawanshi）、迪维安希·查布拉（Divyanshi Chhabra）、拉杰库马尔·马拉亚兰迪（Rajkumar Malayandi）
印度比哈尔邦哈吉普尔（Hajipur）Zandaha路，NH322号，出口促进工业园区（EPIP）国家制药教育与研究学院（National Institute of Pharmaceutical Education and Research）药学系，邮编844102
摘要
了解药物物质的降解行为对于合理选择制剂策略、包装材料和储存条件至关重要。强制降解研究提供了关于药物降解的关键信息，并且是法规提交所必需的。厄洛替尼盐酸盐（Erlotinib hydrochloride，简称ERL）是一种第一代口服酪氨酸激酶抑制剂，用于治疗转移性非小细胞肺癌。迄今为止，只有少数研究报道了ERL的强制降解情况以及基于液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）的杂质分析方法，而没有研究描述针对ERL-聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）系统的反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法。本研究使用RP-HPLC和LC-HRMS对ERL进行了全面的强制降解研究并表征了其杂质。RP-HPLC方法采用C18柱，以50 mM醋酸铵：乙腈（45:55 % v/v）作为流动相，流速为1 mL/min，检测波长为246 nm。该方法按照ICH Q2(R2)标准进行了验证，并成功应用于ERL-PLGA预混剂的分析。LC-HRMS分析在正离子和负离子模式下进行，扫描范围为100–2000 m/z。强制降解研究表明，在氧化和酸性条件下ERL会发生显著降解。共鉴定出14种杂质，包括来自酸环境的杂质1（m/z 412.1856）和杂质3（m/z 430.1515），以及来自氧化环境的杂质2（m/z 410.1697）、杂质9（m/z 380.1595）和杂质10（m/z 414.1647），其余杂质为工艺相关杂质。计算机模拟毒性预测显示，ERL及其杂质主要具有免疫毒性和呼吸毒性。使用AGREE、Complex-GAPI和BAGI等评估工具，确认了该方法的环保性和分析性能。
引言
药品的安全性和有效性是确保其整体质量和临床可靠性的关键因素。活性药物成分的化学稳定性至关重要，因为即使微量的杂质也可能带来严重的毒理学风险或导致严重的不良反应[1]。因此，在药品开发阶段和法规提交过程中，了解药物的内在稳定性、杂质谱及在不同环境和应力条件下的降解途径是必不可少的[2]。了解药物的稳定性和降解行为有助于合理选择制剂策略、包装材料和储存条件，并有助于准确确定产品的保质期[3]。强制降解研究提供了药物在热、氧化、酸、碱和光解等不同应力条件下的稳定性和降解途径信息，这些信息是新药申请（NDA）和临床研究申请（IND）所必需的[4]。国际协调理事会（ICH）制定了多项关于药物物质和药品应力测试及杂质分析的指南，包括Q1A (R2)（新药物物质和产品的稳定性测试）[5]、Q3A (R2)（新药物物质中的杂质）[6]和Q3B (R2)（新药品中的杂质）[7]。此外，ICH M7 (R2)强调了药品中致突变杂质的评估和控制[8]。强制降解研究还有助于验证分析方法在存在降解产物、杂质和制剂基质的情况下对药物进行定量测定的特异性[9]。反相高效液相色谱（RP-HPLC）结合紫外/光电二极管（UV/PDA）检测器因其选择性和稳健性而被广泛用于常规稳定性研究；而液相色谱与高分辨率质谱（LC-HRMS）结合使用则能提供定性和结构鉴定信息，包括分子的分子量、分子式和结构信息，甚至可以识别那些无法通过UV/PDA检测器检测到的杂质[10]。RP-HPLC方法与LC-HRMS的结合使用，可以全面了解药物物质在散装形式和制剂形式中的杂质谱和降解途径。厄洛替尼盐酸盐（ERL）是一种第一代口服酪氨酸激酶抑制剂，用于治疗转移性非小细胞肺癌（NSCLC）。该药物于2004年首次获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，作为至少一种化疗方案失败后的二线或三线治疗手段[11]。ERL是一种喹唑啉胺衍生物，化学式为N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺盐酸盐，分子量为C22H23N3O4·HCl，分子量为429.90 g/mol。其游离碱的分子量为393.43 g/mol[12]。ERL可逆地结合到NSCLC中过度表达的表皮生长因子受体（EGFR）的ATP结合位点，从而抑制促进癌细胞生长、增殖和存活的信号通路[13]。ERL属于BCS II类药物，水溶性较差且渗透性高，在pH 2时的最大水溶性为0.4 mg/mL，pKa值为5.42[14]。它微溶于甲醇，几乎不溶于乙腈、乙酸乙酯和丙酮[12]。ERL以Tarceva?品牌以25 mg、100 mg和150 mg的口服片剂形式上市。临床研究表明，ERL可提高肺癌患者的客观反应率、无进展生存期和生活质量[15]。然而，需要终生每日服药以及口服药物吸收的药代动力学变异性限制了患者的依从性[16][17]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种由乳酸和羟基乙酸组成的合成共聚物，由于其可生物降解性和生物相容性，被美国FDA认定为安全物质（GRAS列表）[18]。基于PLGA的长效注射剂可以实现每周或每月一次的控释，从而提高患者的依从性和治疗效果[19]。因此，定量测定PLGA基质中的ERL含量，以及了解其化学稳定性、主要杂质和降解途径，对于合理设计和开发ERL载药PLGA给药系统至关重要。
文献调查显示，已有多种RP-HPLC和LC-HRMS方法用于ERL的测定（表1）。大多数RP-HPLC方法是针对散装药物物质和片剂剂型中的ERL及其相关杂质开发的。此外，还有基于HPLC的生物分析方法用于血浆和其他生物基质中ERL及其代谢物的定量分析。然而，目前尚未有针对PLGA等聚合物给药系统中ERL的定量测定方法，因为聚合物-药物相互作用可能影响定量准确性。这凸显了开发一种简单、稳健且精确的RP-HPLC方法来定量测定PLGA基质中ERL的必要性。
此外，已报道的ERL LC-HRMS方法主要集中在人和动物血浆中的药代动力学分析。迄今为止，仅有两项LC-HRMS研究报道了ERL相关杂质的鉴定和结构表征，且这些研究仅限于特定的应力条件。研究9（表1）仅涵盖了少数应力条件，并仅报告了三种降解产物。研究12（表1）探讨了氯化作用对ERL结构变化和杂质形成的影响。因此，本研究强调需要在广泛的温度和应力条件下进行广泛的ERL强制降解研究，随后对生成的降解产物进行基于质量的鉴定和结构表征。
本研究的主要目标是：(i) 开发并验证一种结合紫外检测器的RP-HPLC方法，用于定量测定PLGA基质中的ERL；(ii) 在酸性、碱性、氧化、热和缓冲条件下进行广泛的强制降解研究；(iii) 使用LC-HRMS鉴定和表征降解产物；(iv) 将验证的方法应用于商业片剂制剂和药物-PLGA预混剂。此外，还将对鉴定出的杂质进行计算机模拟毒性评估，并使用绿色分析化学指标评估所开发RP-HPLC方法的环保性和可持续性。
部分内容摘录
化学物质和试剂
ERL（批号240704324564，纯度100.1%）从印度孟买的Simson Chemie公司购买。PLGA 75:25酯端基（批号X0009）、PLGA 75:25酸端基（批号X00216）、PLGA 65:35酸端基（批号DLG6535W009）、PLGA 50:50酯端基（批号X00253）和PLGA 50:50酸端基（批号X00134）从印度瓦多达拉的Nomisma Healthcare Pvt. Ltd.公司购买。醋酸铵（HPLC级，批号0034）购自Ottokemi公司RP-HPLC方法开发
RP-HPLC方法的初步开发使用了C18固定相和多种流动相组合。表2展示了HPLC方法开发的初步试验结果。评估了多种水相和有机相的比例和浓度，以获得最佳的色谱性能。ERL是一种亲脂性化合物，具有弱碱性，pKa值为5.42，log P值为2.70结论
本研究利用经过验证的RP-HPLC-UV和LC-HRMS技术，全面评估了ERL在不同应力条件下的内在稳定性和强制降解行为。结果表明，ERL在氧化和酸水解条件下极易降解，而在碱性、缓冲液、热和光解条件下相对稳定。LC-HRMS分析成功鉴定并表征了约14种杂质CRediT作者贡献声明
阿努莫尔·约瑟夫（Anumol Joseph）：撰写初稿、方法学设计、概念构思。赛迪库尔·阿克巴尔（Sideequl Akbar）：撰写、编辑、数据管理。阿达尔什·马尔加维（Adarsh Malgave）：撰写、编辑、验证、项目管理。鲁图贾·苏里亚万希（Rutuja Suryawanshi）：正式分析、数据管理。迪维安希·查布拉（Divyanshi Chhabra）：验证、方法学设计。拉杰库马尔·马拉亚兰迪（Rajkumar Malayandi）：撰写、编辑、监督、概念构思。科学写作中关于生成式AI的声明
本手稿的科学内容未使用AI工具编写或生成。仅使用基于AI的工具（Grammarly）进行了轻微的语法、语言和拼写校正。所有科学内容、数据解释和结论均为作者独立完成。资助
作者未获得本文研究、作者身份认定和/或发表的任何财务支持。致谢
我们感谢印度化学与肥料部（Ministry of Chemicals and Fertilizers）药学系的支持。同时感谢NIPER哈吉普尔中心仪器设施（Central Instrumentation Facility, NIPER Hajipur）提供的LC-HRMS设备，以及NIPER哈吉普尔药学分析部门（Department of Pharmaceutical Analysis）的Rahul Laxman Gajbhiye博士在LC-HRMS样品分析方面提供的帮助。
