《Middle East Fertility Society Journal》：Omics approaches in embryonic microenvironment research: a narrative review
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本综述系统阐述了多组学技术在胚胎培养与子宫植入两大核心微环境中的最新进展。文章归纳了蛋白质组、代谢组、转录组、基因组及微生物组学等方法所发现的潜在分子生物标志物及其临床价值，并指出现有研究的瓶颈。综述展望了单细胞多组学、空间多组学等新兴技术的应用潜力，提出针对性解决方案，旨在通过多组学整合优化胚胎选择策略、提升子宫内膜容受性评估准确性，最终提高IVF-ET的临床妊娠与活产率。
在生殖医学领域，辅助生殖技术（ART），特别是体外受精-胚胎移植（IVF-ET），已成为应对全球不孕率上升的主要策略。其成功核心取决于胚胎质量、培养条件和子宫内膜容受性。目前主流的择期单囊胚移植（eSBT）虽可降低多胎妊娠风险，但因形态学评估的局限性，仍缺乏标准化的高预测性选择标准。高通量测序技术的出现，推动了胚胎微环境研究从单一组学分析向整合的多组学（蛋白质组、代谢组、转录组、基因组、微生物组等）范式转变，为胚胎发育与植入提供了全面的分子视角。
胚胎培养微环境
研究证实，胚胎培养微环境对胚胎发育、IVF-ET妊娠结局乃至子代长期健康具有关键影响。其中，胚胎培养液构成了胚胎体外发育最关键的微环境。近年来，对胚胎培养微环境的无创分析已成为研究热点，主要集中在两方面：一是分析用过的囊胚培养液（SBM）中的游离DNA（cfDNA）；二是深入探索SBM代谢组或蛋白质组谱与胚胎活力之间的关联。这些无创策略有望补充和优化传统的形态学评估，提高临床胚胎移植选择的准确性。
蛋白质组学研究
目前蛋白质组学对胚胎植入结局的临床预测能力仍有限，主要受限于培养液样本蛋白丰度极低、常规检测仪器灵敏度不足以及与生殖医学相关的蛋白质组数据库注释不全。尽管如此，质谱（MS）技术凭借高灵敏度、优越的分析稳健性和良好的重现性，在一定程度上克服了这些限制，成为临床蛋白质组学研究中识别胚胎发育和植入相关潜在蛋白质生物标志物不可或缺的核心技术。
多项研究比较了已植入与未植入囊胚培养液的蛋白质谱，发现了一系列具有潜在预测价值的差异表达蛋白。例如，有研究发现植入囊胚培养液中sTNF-R1和IL-10水平显著升高，而MSP-α、SCF、CXCL13、TRAIL-R3和MIP-1β显著降低。另有研究则识别出多种植入相关蛋白表达升高，包括粘附分子（EPHB4, SELE, ALCAM, JAM-A）、趋化因子（MCP-1/CCL2, CCL24）和信号因子（FAS, PDGF-A），凸显了细胞粘附和免疫调节在胚胎植入中的关键作用。还有研究发现caspase-3和HRG（富含组氨酸的糖蛋白）可能作为胚胎质量的潜在标志物。在众多蛋白质生物标志物中，sHLA-G是验证最一致的标志物之一，其分泌水平升高与临床妊娠率显著相关。总体而言，基于质谱的蛋白质组学是识别胚胎微环境中预测标志物的更有效方法，整合多个蛋白质生物标志物而非单一标志物，有望显著提高胚胎植入结局的预测准确性。
代谢组学研究
胚胎代谢组学通过分析培养液中代谢物的光谱，研究胚胎代谢组与发育潜能之间的内在联系。作为一种无创、实时、客观的检测方法，代谢组学已被广泛应用于植入前胚胎研究，多种代谢物已被确定为评估胚胎质量、倍体状态甚至胚胎性别的潜在预测生物标志物。
开创性的小鼠胚胎研究发现，三磷酸腺苷（ATP）水平与胚胎发育潜能呈显著正相关。随后的临床研究进一步证实，发育停滞的胚胎代谢活性显著受损，表现为丙酮酸消耗、葡萄糖利用和乳酸输出明显减少。值得注意的是，葡萄糖和丙酮酸在胚胎发育的不同阶段具有不同的预测价值：多项研究表明，培养中期葡萄糖摄取升高与人类胚胎的优妊潜能相关；而发育后期丙酮酸的消耗是胚胎性别判定最可靠的代谢指标。氨基酸动态变化也对胚胎发育具有重要预测价值：支链氨基酸（BCAAs—缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）在发育停滞胚胎中的代谢显著增强；净氨基酸周转率（总消耗加产生）是囊胚形成潜能的独立预测因子。因此，对胚胎培养液进行无创代谢物分析已成为ART领域的关键研究重点，建立标准化的代谢阈值有望在临床实践中实现客观、准确地选择具有高发育潜能的胚胎。
转录组学研究
人类胚胎转录组研究长期受限于高质量样本获取难以及微量样本中低丰度RNA检测的技术挑战。然而，微阵列技术和高通量RNA测序（RNA-seq）的快速发展显著提升了转录组分析能力，使得对植入前胚胎及其培养液中编码和非编码RNA表达的全面分析成为可能。
非编码RNA，尤其是微小RNA（miRNAs），是胚胎培养微环境转录组学的主要研究焦点，因为它们在培养液中稳定表达且易于检测。比较分析发现，在已植入的整倍体囊胚SBM中，miR-20a和miR-30c的浓度显著高于未植入的囊胚。生物信息学分析进一步将这两种miRNA与23个关键的植入相关通路联系起来。对于编码RNA研究，单细胞RNA-seq克服了批量测序的局限，使得在单细胞水平分析植入前胚胎的基因表达特征成为可能。有研究分析了88个人类植入前胚胎的1,529个细胞的单细胞转录组，揭示了囊胚形成过程中滋养外胚层、上胚层和原始内胚层谱系建立之前存在阶段特异性基因共表达的中间状态。另一项研究通过RNA-seq，在已植入与未植入囊胚的上胚层细胞中识别出47个显著差异表达的转录本。最重要的是，一项独立的临床研究验证了RNA-seq用于胚胎选择的临床价值，证明其对妊娠结局的预测准确性显著优于传统的形态学评估，为胚胎移植前基于RNA的筛查奠定了基础。
基因组学研究
无创植入前非整倍体遗传学检测（niPGT-A）已成为传统有创PGT-A（基于滋养外胚层活检）的有前景的替代方案。胚胎的培养液（SCM）已成为最重要的无创遗传物质来源，因为它含有胚胎正常发育过程中释放的cfDNA。
研究发现，SCM中的DNA含量有时可能高于囊胚腔液，凸显了SCM是真正的无创遗传物质来源。为优化临床检测方案，有研究调查了不同发育阶段SCM中cfDNA含量和检测准确性，证实cfDNA在第3天和第5天的培养液中均可检测到，但在第5天的准确性显著更高，为临床实践中SCM的最佳采集时机提供了明确参考。
尽管前景广阔，但目前基于SCM的遗传分析仍处于探索阶段，其结果尚缺乏足够的可靠性用于常规临床应用，主要受限于多个技术瓶颈：首先，检测结果易受培养体积、单个与群体胚胎培养、低cfDNA检出率等外部变量影响；其次，等位基因脱扣（ADO）是SCM扩增中常见的技术问题，可能导致假阴性结果；第三，DNA扩增程序本身存在污染风险，在开放培养系统中这种风险加剧。一项关键研究发现，培养液中常见的添加剂人血清白蛋白（HSA）是非胚胎外源污染的主要来源。这与另一项观察到SCM中92%的DNA来源于外源的结论一致。因此，niPGT-A的临床转化仍需进一步研究，并建立标准化的检测和污染控制方案。
子宫微环境
胚胎植入是一个复杂、受时空调控的多步骤生物学过程。这一过程的成功完成依赖于下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴的精确调控。作为胚胎移植的最终部位，子宫腔微环境对植入成功、后续胚胎发育和整体妊娠结局具有关键影响。值得注意的是，不孕女性子宫微生物群的动态变化或失调可能扰乱局部免疫反应和炎症状态，可能破坏子宫内膜容受性窗口，降低植入效率。近年来，多种多组学技术被广泛应用于解码子宫微环境的分子和微生物特征，通过分析子宫微生物群组成、子宫内膜液蛋白表达和代谢物浓度来评估子宫内膜容受性或预测IVF结局，为不孕症和反复种植失败（RIF）的临床干预提供了新的分子靶点。
微生物组研究
长期以来，健康女性的子宫腔被认为是一个无菌环境，这极大限制了子宫微生物群及其在生殖健康中作用的研究。然而，随着高通量16S rRNA基因测序技术的发展，当代研究已明确证明，阴道和宫颈微生物群可以上行并定植于子宫内膜环境，形成一个独特且动态的子宫微生物群落。尽管不同研究在样本量、检测部位和研究设计上略有差异，但核心研究共识是一致的：以乳酸杆菌为主的子宫微生物群结构是生殖健康的最佳微生物模式，任何偏离此模式（菌群失调）都与不良IVF结局密切相关。
有研究分析了152名患者在胚胎移植时的阴道宫颈微生物群样本，观察到未检测到微生物定植的患者的着床率（14.0%）略高于定植阳性患者（12.4%）。另一项研究通过16S rRNA基因测序对更大样本量进行了子宫微生物群表征，在278个已鉴定的菌属中，黄杆菌属和乳酸杆菌属在持续妊娠和非持续妊娠组中均占主导地位，其中乳酸杆菌总体流行率最高。其研究证实，异常与正常阴道菌群组的生化妊娠率无显著差异，但异常菌群组的临床妊娠率显著降低。一项经典研究进一步验证了以乳酸杆菌为主的微生物群的临床价值：与非乳酸杆菌为主的受试者相比，乳酸杆菌为主的受试者着床率、妊娠率、持续妊娠率和活产率均显著更高，而以加德纳菌或链球菌为主的微生物群与不良IVF结局的相关性最强。
值得注意的是，当前研究已阐明了与IVF结局相关的子宫微生物群的两个关键特征：第一，细菌群落多样性在子宫内膜容受性窗口期间没有显著改变，也不显著影响IVF结局；第二，经历反复种植失败的女性阴道微生物多样性显著更高，乳酸杆菌丰度降低，这表明RIF与微生物失调有关，而非简单的多样性变化。另有研究进一步提出，以益生菌群（如乳酸杆菌）耗竭和病原体（如加德纳菌和链球菌）过度生长为特征的微生物群，可能是IVF失败率升高的潜在分子指标。此外，一项新研究首次报道子宫内膜液含有多种抗菌蛋白和内源性抗菌肽，这些可能有助于维持子宫微生物稳态，并可能防止对生殖结局产生不利影响的微生物群失调，为子宫微生物群的临床调控提供了新的研究方向。
蛋白质组学研究
子宫内膜液作为植入过程中胚胎-子宫内膜沟通的直接介质，富含蛋白质、代谢物和信号分子，其蛋白质组成动态反映了子宫内膜的功能状态。因此，子宫内膜液的蛋白质组分析已成为识别子宫内膜容受性生物标志物的最重要研究方法，一系列差异表达蛋白已在非容受性子宫内膜或RIF患者的子宫内膜液中被识别，为了解子宫内膜容受性调控提供了重要的分子线索。
一项研究在胚胎移植日对子宫内膜液进行了全面的蛋白质组分析，识别出非容受性子宫内膜与容受性子宫内膜相比有212个显著失调的蛋白质。生物信息学分析显示，这些失调蛋白主要参与炎症反应和免疫调节。研究人员在独立的临床队列中验证了PYGB的差异表达，提出其可作为子宫内膜容受性和植入成功的潜在特异性生物标志物。另一项研究补充了这一发现，识别了植入窗口期ANXA6的表达失调。为阐明月经周期中子宫内膜蛋白质组的动态变化，有研究分析了分泌期子宫内膜液的蛋白质组，发现与免疫反应、凝血级联和糖酵解相关的蛋白质从早期到中期分泌期显著增加，而介导DNA复制/转录的蛋白质减少，这种蛋白质组演变与子宫内膜向容受性状态的转变高度一致，为定义植入窗口提供了分子基础。近年来，子宫内膜蛋白质组学研究已扩展到细胞外囊泡（EVs）：有研究表征了从子宫灌洗液中分离的子宫内膜EVs的蛋白质组，识别了EVs中的多种植入调控蛋白，并建立了一个能够准确预测植入窗口的特定蛋白质组特征。这项研究强调了EV相关蛋白作为子宫内膜容受性评估的有前景的无创生物标志物，相对于传统的有创子宫内膜活检方法具有显著的临床优势。
代谢组学研究
子宫微环境的代谢特征对胚胎植入和早期胚胎发育至关重要，因为代谢物不仅为囊胚提供必需能量，还通过信号传导介导胚胎-子宫内膜的相互作用。小鼠妊娠模型已确定，生物活性脂质是早期妊娠事件的核心调节因子；其中，前列腺素（PGs）是子宫内膜容受性研究中表征最广泛的脂质介质，在胚胎-子宫通讯、血管重塑和子宫内膜蜕膜化中具有明确作用。
一项关于人类子宫内膜液的临床研究表明，在自然月经周期和冻融胚胎移植（FET）周期中定义的植入窗口期间，PGE2和PGF2α浓度均显著升高；这两种PGs的动态变化受性激素严格调控，它们在胚胎移植前24小时的浓度水平是子宫内膜容受性的潜在无创生物标志物。为识别与植入失败相关的代谢生物标志物，有研究分析了植入成功和失败患者子宫内膜液的脂质谱，识别出15个与植入失败相关的特定离子；后续的前瞻性研究进一步将其缩小为经历植入失败的个体子宫内膜液中8个显著改变的代谢物，包括ω-6和ω-7甘油磷脂。这两种代谢物在早期妊娠中具有不同的功能作用：ω-6是发育中胎儿的关键能量来源，而溶血磷脂是细胞内脂质介质，可触发子宫内膜的炎症反应。这些代谢物的失调表明，子宫微环境中的能量代谢紊乱和异常炎症反应均与植入失败密切相关。总的来说，子宫内膜代谢物和代谢途径的这些改变不仅揭示了植入失败的分子机制，也为不孕症、妊娠疾病和预测胚胎移植结局提供了有前景的新诊断标志物和治疗靶点。
转录组学研究
转录组技术是子宫微环境研究中最成熟和应用最广泛的组学技术；最近的转录组研究广泛调查了子宫内膜的分子特征，特别是其容受性状态，并识别了一系列与子宫内膜容受性和RIF相关的关键基因和非编码RNA，为开发子宫内膜容受性诊断工具奠定了坚实的分子基础。
一项对现有子宫内膜容受性生物标志物研究的系统荟萃分析，识别出SPP1和IL15是非容受性子宫内膜中反复失调的基因。其中，SPP1是一种介导细胞粘附和迁移的糖蛋白，是大多数报道的子宫内膜容受性基因集中唯一的共同因子，涉及脂质代谢、免疫调节和细胞周期控制等多个关键生物学过程。IL15则与子宫免疫细胞的调节密切相关，可能作为局部孕前免疫微环境的潜在标志物。同时，另一项研究发现增殖期和容受期子宫内膜之间长链非编码RNA和小非编码RNA的表达存在显著差异，表明非编码RNA在子宫内膜容受性建立中起关键调控作用。还有研究将RIF与子宫内膜中异常基因表达谱联系起来，提出这些异常可能由受损的孕酮信号传导介导，从内分泌-转录组调控的角度阐明了RIF的分子机制。进一步的研究表征了RIF特异性的子宫内膜转录组，报告并验证了RIF患者与生育对照者之间差异表达的miRNAs及相关分子调控网络。
为利用这些重要研究发现，已开发出多种评估子宫内膜容受性的诊断工具：子宫内膜容受性芯片（ERA）是第一个基于子宫内膜转录组谱商业化的诊断工具，可以准确确定患者的个体植入窗口并指导个性化胚胎移植。随后的前瞻性临床研究验证了ERA在提高妊娠率方面的临床价值，尽管也注意到与生理性子宫内膜功能存在一些不一致，这限制了其广泛应用。最近，出现了更新、更全面的方法，如子宫内膜容受性图谱（ER Map/ER Grade）和ReceptivaSeq（rsERT），它们整合了更多转录组数据，提高了子宫内膜容受性评估的准确性。
总之，高通量转录组测序全面阐明了阶段特异性的子宫内膜基因表达谱，包括调控性miRNA和lncRNA序列；对这些转录组数据进行整合的生物信息学分析，能够更深入地研究容受期基因表达及其潜在的调控机制，有望进一步推进如RIF等植入障碍的诊断和治疗策略。
现状与展望
全球育龄夫妇不孕症发病率持续上升，而辅助生殖技术（ART）的进步使IVF-ET成为主要治疗方式。提高临床妊娠率和减轻不良结局的努力，日益聚焦于体外培养系统和子宫植入生态这两个关键的胚胎微环境。因此，多组学整合已成为生殖医学的一个关键研究前沿。
尽管过去十年在胚胎微环境的多组学研究方面取得了实质性进展，但一些局限性阻碍了其临床转化：首先是胚胎评估的主观性，植入前胚胎评估仍以形态学为主，观察者间差异大，对植入潜力和发育潜能的预测能力有限。其次是无创评估手段的缺乏，子宫内膜容受性评估主要依赖子宫内膜活检和常规超声检查，缺乏特异性、敏感且无创的分子指标。第三是生物标志物转化的障碍，尽管多组学技术识别了许多潜在生物标志物，但平台间变异性、重现性差、样本量有限以及缺乏标准化检测方案阻碍了其临床应用。此外，各组学方法自身也存在局限：蛋白质组学受限于微量样本中蛋白质丰度低；代谢组学缺乏标准化的参考阈值；基因组学面临外源污染和等位基因脱扣的挑战；微生物组学则缺乏统一的子宫微生物群表征分析方案。
近期技术进步为胚胎微环境研究创造了新机遇。单细胞多组学、空间多组学和人工智能的整合代表了主流的研究方向，有望超越传统局限，提供全面的时空分子见解。单细胞多组学方法在单个细胞分辨率上整合转录组、蛋白质组、代谢组和表观基因组分析，能够剖析植入前胚胎和子宫内膜内的分子特征，克服批量组学固有的细胞异质性掩盖，有助于识别囊胚形成过程中的谱系特异性表达谱，并阐明植入过程中胚胎-子宫内膜的分子对话。单细胞分辨率有望产生更特异、更敏感的胚胎质量和子宫内膜容受性评估生物标志物。空间多组学技术通过在组学分析过程中保持组织结构，解码植入窗口期间子宫微环境内基因表达、蛋白质分布和代谢物积累的时空调控。这种能力对于研究胚胎-子宫内膜相互作用尤为重要，因为它揭示了植入位点分子信号的动态空间变化——这是传统方法难以解决的基本问题。通过高级生物信息学整合来自多个组学平台的数据集，可以构建胚胎微环境的综合分子调控网络。这种整合规避了单一组学研究固有的简化论，识别核心通路和关键生物标志物，并提高对IVF-ET结局的预测准确性。与人工智能的整合代表了一项重大的方法论进步：机器学习算法可高效处理高维多组学数据，构建用于胚胎评估和子宫内膜容受性表征的稳健预测模型。
促进多组学发现向临床转化，需要通过针对性策略解决当前的方法学局限。首先是建立国际标准化方案，方案异质性是平台间变异性和重现性差的主要来源。就标准化检测和分析方案达成国际共识至关重要。其次需要开展大规模多中心合作研究，个体研究受限于样本量有限和人群特异性特征，多中心合作可以为验证研究提供足够的效力，评估生物标志物在不同种族和地区人群中的表现，并产生临床采用所需的证据基础。第三是开发专门的生殖组学数据库，当前数据库缺乏全面的生殖医学注释，需要建立专门的高质量存储库，整合来自生育和不育人群（包括反复种植失败和复发性流产）的多组学数据，以支持生物标志物识别、功能注释和验证。第四是推进高灵敏度和无创技术，解决技术瓶颈需要跨学科解决方案，例如用于检测培养液中低丰度蛋白质的超高灵敏度质谱、用于无创植入前非整倍体遗传学检测的封闭培养系统和污染控制，以及用于胚胎代谢谱分析的精炼单细胞代谢组平台。最后是促进跨学科合作，胚胎微环境研究本质上跨越生殖医学、组学技术、生物信息学、人工智能和分子生物学，加强跨学科整合将加速解决复杂的科学和技术挑战，并加快转化进程。
多组学研究的成功转化有望在多个维度改变临床ART实践。整合多组学生物标志物将能够开发客观、无创的胚胎选择平台，取代主观的形态学评估，准确识别具有最高发育潜能和最低非整倍体风险的胚胎。多组学分析将允许精确、个体化地确定植入窗口并进行全面的容受性表征，为个性化干预（包括激素调节、微生物群操作和分子靶向治疗）提供信息，以优化子宫内膜条件，最大化植入成功率。人工智能驱动的模型整合胚胎和子宫内膜的多组学数据，将准确预测个体妊娠结局，促进从经验性生殖医学向精准生殖医学的过渡，实现个性化的ART治疗策略。多组学研究将识别不孕症和反复种植失败中的核心分子通路和治疗靶点，为调控胚胎微环境提供靶向干预措施，为难治性疾病患者提供新的治疗选择。
总之，多组学整合代表了胚胎微环境研究必然的发展方向。新兴技术——单细胞多组学、空间组学和人工智能——的融合将进一步加速该领域的进展。尽管仍存在重大的方法论挑战，但多组学发现的成功临床转化有望显著提高ART的疗效和安全性，为全球数百万不孕夫妇带来新的希望。
