利用基于样品位置的13C/15N固态核磁共振技术对脂质双层中的裂殖视紫红质1（schizorhodopsin 1）进行了分析

《Biophysical Chemistry》：Site-resolved 13C/15N solid-state nuclear magnetic resonance analysis of schizorhodopsin 1 in lipid bilayers

schizorhodopsin 1 (SzR1)通过固体核磁共振（固态NMR）技术研究其在脂双层环境中的结构，发现Glu81羧基去质子化可能作为质子受体，Arg67胍基参与外部氢键网络，证实固态NMR可解析膜蛋白原子级结构，为质子运输机制提供新见解。

　　

北口昭人（Akito Kitaguchi）、金泽拓海（Takumi Kanazawa）、長島敏夫（Toshio Nagashima）、山崎敏夫（Toshio Yamazaki）、沖津隆（Takashi Okitsu）、井上圭一（Keiichi Inoue）、川村泉（Izuru Kawamura）

横滨国立大学工程科学研究生院，日本神奈川县横滨市240-8501

摘要

裂殖视紫红质（Schizorhodopsin，简称SzR）是一种与视网膜结合的膜蛋白，可作为光驱动的质子转运蛋白。固态核磁共振（Solid-state Nuclear Magnetic Resonance，简称NMR）光谱技术为揭示水合脂质双层环境下的膜蛋白原子级结构特征提供了强有力的方法。在本研究中，我们基于通过广泛序列共振分配获得的¹³C/¹⁵N化学位移信息，对裂殖视紫红质1（SzR1）的静息状态进行了位点特异性结构分析。通过结合反向同位素标记和基于REDOR技术的魔角旋转（magic-angle spinning）下的偶极重耦合实验，以及传统的三维固态NMR实验，实现了信号识别。结果表明，大约80%的残基得到了共振分配。化学位移分析显示，SzR1中C螺旋上的Glu81羧基处于脱质子状态，这与其作为质子受体的潜在作用一致；而Arg67的胍基则强烈参与了蛋白质细胞外侧部分的氢键网络。这些发现证明了固态NMR能够提供详细的位点特异性信息，并为SzR1在类似天然状态的膜环境中的功能提供了新的见解。

引言

膜蛋白对生命至关重要，它们介导离子转运、信号转导和能量转换等过程。然而，由于需要维持其天然脂质环境，因此在生理条件下阐明它们的原子级结构仍然是一个巨大的挑战。固态核磁共振（NMR）光谱技术已成为这一目的不可或缺的非侵入性技术，能够对脂质双层中的膜蛋白及相关肽进行结构和动态表征[1]、[2]、[3]。超快魔角旋转（Ultrafast Magic-Angle Spinning，简称MAS）、动态核极化（Dynamic Nuclear Polarization，简称DNP）、GHz级NMR光谱、MAS冷冻探针以及先进的同位素标记策略的最新发展显著提高了NMR光谱的分辨率和灵敏度，使得可以对多种包含脂质双层的膜蛋白进行详细研究，例如细胞色素b₅、SARS-CoV-2包膜蛋白、Cl^?泵送视紫红质、人类水通道蛋白以及通过转运脂多糖产生膜不对称性的蛋白质复合体[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。在固态NMR中，诸如偶极辅助旋转共振（Dipolar-Assisted Rotational Resonance，简称DARR）和旋转回波双共振（Rotational Echo Double Resonance，简称REDOR）等技术利用了同核和异核偶极相互作用，在MAS条件下获取结构信息[12]、[13]、[14]。质子驱动的自旋扩散和DARR重新引入了如¹³C核之类的同核偶极耦合，从而实现相邻核之间的磁化转移，提供了距离信息[15]、[16]。REDOR选择性地重新耦合了如¹³C和¹⁵N之类的异核偶极相互作用，导致信号退相，从而可以进行定量的核间距离测量。此外，通过将反向标记的蛋白质与频率选择性REDOR（fsREDOR）结合，可以选择性抑制或分离特定蛋白质的信号[17]、[18]。这些方法共同展示了如何利用核自旋相互作用来提取固体中的空间信息。

微生物视紫红质是一种七次跨膜螺旋蛋白，它通过质子化的视黄醛席夫碱（Protonated Retinal Schiff Base，简称PRSB）将全反式视黄醛色素共价结合到G螺旋中的一个保守赖氨酸残基上[19]。它们的生物活性由视黄醛色素的光驱动光异构化引发，这一反应是光驱动的质子泵细菌视紫红质（Bacteriorhodopsin，简称BR）等功能的基础[19]。宏基因组调查发现了大量的微生物视紫红质基因，极大地扩展了这些蛋白质的序列和功能多样性[19]、[20]、[21]、[22]。个体功能通常由特定的氨基酸基序和PRSB周围的局部环境决定，微生物视紫红质已被证明可作为离子泵、离子通道和信号转导的光受体。

阿斯加德古菌（Asgard Archaea，属于Promethearchaeati界）被认为是真核生物古菌祖先的最近亲属。已发现含有视紫红质基因的阿斯加德古菌基因组[23]。在这些视紫红质基因中，除了典型的微生物视紫红质和光感受视紫红质（heliorhodopsins）外，还存在一个位于系统发育树中间位置的新家族，称为裂殖视紫红质（Schizorhodopsin，简称SzR）家族[24]。当表达SzR1的大肠杆菌（Escherichia coli）细胞受到光照时，观察到细胞外pH值升高。相反，当添加增强细胞膜H⁺通透性的质子载体羰基氰化物m-氯苯肼（carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone）时，光照引起的pH变化显著减弱[24]。随后在表达SzR1的哺乳动物细胞上进行了膜片钳实验，发现即使在逆转电化学梯度的膜电位下，SzR1仍继续向细胞内转运H⁺[24]、[25]。SzR1在膜内形成三聚体结构[24]。一种同源蛋白SzR4的X射线晶体结构以2.1 ?的分辨率被解析，揭示了构成质子转运途径的残基，并显示B螺旋和F螺旋的细胞质末端比BR中的更短[26]。此外，虽然典型视紫红质在C螺旋和G螺旋中具有两个Asp残基作为PRSB的反离子，但SzR仅保留了G螺旋中的一个。拉曼光谱显示，在SzR的光循环过程中，视黄醛席夫碱的重质子化之前会发生顺反式热异构化，这一顺序在其他质子泵视紫红质中并未观察到，这强烈表明这是SzR家族的普遍特征[27]。由于在Methanoculleus taiwanensis和Methanoculleus属中也发现了SzR基因，因此这些物种衍生的视紫红质MtSzR和MsSzR也作为质子泵发挥作用，并表现出极高的热稳定性[28]。

尽管SzR的质子内向转运的生理作用尚不清楚，但作为新型视紫红质家族的分子机制研究正在进行中。固态NMR光谱技术能够对脂质环境中的膜蛋白进行结构分析，也为SzR提供了宝贵的见解。在本研究中，我们对由201个残基和视黄醛色素组成的SzR1在脂质环境中的¹³C和¹⁵N NMR共振进行了分配。

材料与方法

在含有8克均匀¹³C标记的d-葡萄糖（CIL, CLM-1396）和1克¹⁵NH₄Cl（CIL, NLM-467）的2 L M9最小培养基中培养的E. coli C41(DE3)细胞中，过表达了带有C末端His标签的均匀¹³C、¹⁵N标记的SzR1（UCN-SzR1）。通过添加1 mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside）和5 μM¹³C-14,20标记的全反式视黄醛[29]来诱导蛋白质表达，并在37°C下孵育5小时。对于带有Phe、Ile、Leu和Trp的反向标记SzR1的表达...

固态NMR测量

使用Bruker Avance III 600 MHz仪器和4.0 mm无E⁺¹H–¹³C-¹⁵N探针，观察了¹³C和¹⁵N交叉极化-MAS（CP-MAS）光谱。固态多维MAS¹³C和¹⁵N NMR测量使用了配备3.2 mm无E⁺¹H–¹³C-¹⁵N探针的Avance NEO 700 MHz光谱仪。典型的¹H、¹³C和¹⁵N脉冲长度分别为2.5 μs、3.6 μs和5.0 μs。所有2D和3D实验都在278 K的探针温度和15.75 kHz的MAS频率下进行。

结果与讨论

使用700 MHz光谱仪在黑暗条件下，通过对UCN-SzR1和嵌入POPE/POPG膜的rFILW-SzR1进行2D和3D信号相关实验（DARR、DREAM、NCA、NCO、CANCO、NCACX和NCOCX），获得了光谱分配。图1和图2分别显示了混合时间为20 ms的DARR和NCA光谱。UCN-SzR1（黑色）与rFILW-SzR1（红色）的叠加图显示了脂肪族共振的良好分辨率和信噪比。

结论

总之，我们的多维固态NMR实验结合反向标记技术，提供了关于在水合脂质膜中重组的SzR1的结构见解。序列分配揭示了诸如螺旋间转角和π-凸起以及七次跨膜螺旋结构等特征。此外，包括Arg67的¹⁵Nη分裂信号和Glu81的¹³Cδ在内的残基特异性侧链信息，为氢键的形成提供了证据。

CRediT作者贡献声明

北口昭人（Akito Kitaguchi）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、方法学、研究、形式分析。金泽拓海（Takumi Kanazawa）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、方法学、研究、形式分析。长岛敏夫（Toshio Nagashima）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、方法学、研究。山崎敏夫（Toshio Yamazaki）：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究。冲津隆（Takashi Okitsu）：撰写 – 审稿与...

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了JSPS KAKENHI科研费（资助编号：JP21H05229、JP21H01875、JP23K18090、JP24H02268、JP25H00424）对I.K.的支持，JST CREST（资助编号：JPMJCR21B2、JPMJCR22N2）对I.K.的支持，以及MEXT联合使用/研究系统发展项目：“卓越研究大学联盟”（CURE）（资助编号：JPMXP1323015482）对K.I.的支持。我们还要感谢NMR平台NF23-01-0161和PF25-01-091的支持。