《Gene Therapy》：Beneficial bystander-enhanced cryptic splice rescue of cardiac-type Fabry GLA IVS4+919G>A by adenine base editing in patient fibroblasts
编辑推荐：
本研究针对东亚高发的心肌型法布里病致病突变IVS4+919G>A，在患者来源的成纤维细胞中，利用腺嘌呤碱基编辑工具ABEmax成功逆转了该突变，并意外发现邻近位点（+918/+920）的“旁观者”编辑可进一步抑制致病性隐蔽剪接。该研究恢复了正常GLA mRNA剪接，提升了α-Gal A酶活至接近野生型水平，并显著降低了细胞内Gb3的积累，为通过碱基编辑策略治疗由深内含子剪接突变引起的遗传病提供了概念验证。
在东亚人群，特别是中国台湾地区，有一种特殊类型的法布里病（Fabry disease）尤为高发，其背后的“元凶”是一个位于GLA基因深内含子区的单核苷酸突变——IVS4+919G>A。这个突变像一个“错误的路标”，在细胞进行RNA剪接时，会错误地引导剪接机器识别并插入一段本不该存在的57个核苷酸序列（假外显子），导致编码框架被打乱，最终产生无功能的、截短的α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）蛋白。这种突变导致的疾病类型被称为“心肌型法布里病”，患者通常在中老年时期出现以心肌肥厚为主的心脏病变。尽管酶替代疗法（ERT）是标准治疗手段，但它需要终身频繁静脉输注，费用高昂，且无法根治。因此，科学家们一直在探索能够“一劳永逸”纠正基因缺陷的治疗方法，基因编辑技术为此带来了曙光。其中，碱基编辑技术因其能够在不切断DNA双链的情况下实现精准的单碱基转换，具有潜在的安全性优势。那么，能否利用这项前沿技术来“修正”这个深藏在内含子里的错误路标，从而从根本上治疗这种疾病呢？发表在《Gene Therapy》上的一项研究对此进行了探索。
为了验证这一设想，研究人员主要运用了以下几项关键技术：他们首先从携带IVS4+919G>A突变的男性法布里病患者身上获取了原代皮肤成纤维细胞作为研究模型。接着，他们构建了两种靶向该突变位点的腺嘌呤碱基编辑器（ABEmax）与向导RNA（sgRNA）的复合体（ABEmax-sgRNA1和ABEmax-sgRNA2），并通过电穿孔技术将其递送到患者成纤维细胞中。随后，他们通过Sanger测序和高通量靶向测序来精确量化基因编辑效率；通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）区分并定量正常与异常剪接的GLA mRNA；通过蛋白质印迹法（Western blot）检测GLA蛋白的表达水平；通过酶活性测定评估α-Gal A的功能恢复情况；并通过免疫荧光染色及定量来观察细胞内致病性脂质Gb3的累积是否被清除。
成功纠正GLA IVS4+919G>A突变并在患者来源成纤维细胞中利用腺嘌呤碱基编辑检测到旁观者效应
研究人员设计了两种sgRNA靶向IVS4+919位点。实验证明，ABEmax-sgRNA2的编辑效率更高。测序结果显示，不仅目标位点+919的A被成功转换为G，其相邻的+918和+920位的腺嘌呤（A）也频繁地被转换为鸟嘌呤（G），这种现象被称为“旁观者编辑”。在ABEmax-sgRNA2编辑的细胞群中，+919A>G的转换频率为53%，而+918、+919、+920三个位点同时发生A>G转换（AAA>GGG）的频率也达到了30.9%。
通过腺嘌呤碱基编辑在患者来源成纤维细胞中恢复GLA功能
基因编辑在mRNA、蛋白质和酶活性多个层面均取得了显著效果。qRT-PCR分析显示，经过ABEmax-sgRNA1或sgRNA2编辑的细胞，其正常GLA mRNA的表达量显著提升，而异常剪接的mRNA转录本则大幅减少。蛋白质印迹分析证实，编辑后的细胞GLA蛋白表达量明显增加。更重要的是，α-Gal A的酶活性得到了大幅恢复，其中ABEmax-sgRNA2编辑的细胞群酶活性平均达到了野生型水平的105.6%。
通过单细胞克隆产生的不同基因型有效恢复GLA表达和功能
为了明确不同编辑基因型（基因型）的具体效果，研究人员从ABEmax-sgRNA2编辑的细胞中分离并扩增了单细胞克隆，主要获得了三种基因型：仅+919A>G、+920A>G、以及+918+920AAA>GGG。功能分析表明，所有这三种基因型的单克隆细胞都表现出正常GLA mRNA表达显著升高和异常转录本大幅降低。其中，携带+918+920AAA>GGG旁观者编辑的克隆，在恢复正常mRNA表达和降低异常转录本方面表现尤为突出，部分克隆的GLA蛋白表达量和酶活性甚至达到或超过了野生型水平。
编辑细胞中细胞内Gb3积累的清除
清除细胞内累积的底物Gb3是治疗有效的关键生理指标。免疫荧光定量分析显示，与未编辑的患者细胞相比，携带+919A>G或+918_+920AAA>GGG编辑的单个细胞克隆，其细胞内的Gb3荧光信号强度均出现了极显著的下降，这表明基因编辑在功能上有效逆转了细胞的病理表型。
使用ABEmax-sgRNA2对GLA碱基编辑的脱靶效应评估
安全性评估至关重要。通过Cas-OFFinder预测和靶向高通量测序验证，研究人员在11个预测的潜在脱靶位点中，仅在一个位点（位于SHOC2基因的内含子区）检测到低频率的A-to-G编辑，且该编辑位于非编码区，预测不会影响蛋白质编码或剪接。这表明ABEmax-sgRNA2系统在编辑IVS4+919G>A时具有较高的特异性。
研究结论与讨论
本研究成功在患者成纤维细胞模型中实现了对心肌型法布里病高发突变IVS4+919G>A的体外基因治疗概念验证。研究最有趣的发现是，通常被视为副作用的“旁观者编辑”，在本研究针对深内含子剪接突变的情境下，可能产生了增强的治疗效果。特别是+918_+920AAA>GGG这种多一位点编辑，在抑制异常剪接、恢复正常mRNA和蛋白表达方面展现出不逊于甚至优于单纯纠正+919位点的潜力。作者推测，这可能是因为该突变区域的A/C富集序列是一个剪接增强子元件，多一位点的编辑更彻底地破坏了这个增强子，从而更有效地抑制了隐蔽剪接的发生。
在讨论中，作者强调了该突变在东亚人群中的高流行率（台湾地区男性约1/1600）及早期干预的重要性，因为心脏损伤在出现明显症状前可能已悄然发生。与需要终身治疗的酶替代疗法相比，一次性的基因编辑疗法具有显著优势。同时，作者也指出了本研究的局限性：目前结果仅在成纤维细胞中获得，需要在疾病相关细胞（如心肌细胞、肾足细胞）和动物模型中进行验证；此外，体内递送效率、编辑器的持久性及免疫原性等转化医学问题将是未来研究的重点。
总之，这项研究不仅证明了腺嘌呤碱基编辑治疗由深内含子剪接突变引起法布里病的可行性，还提出了一个新颖的观点：针对非编码区的基因编辑，其旁观者效应可能被转化为治疗优势。这为一系列由类似机制引起的遗传病的基因治疗提供了新的思路和策略。
