《MicrobiologyOpen》：Maintenance of Gut Microbial Balance via the Kynurenine Pathway Improves Larval Performance and Resistance to Bacillus thuringiensis in Spodoptera exigua
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本研究聚焦于夜蛾科昆虫中宿主代谢对肠道微生物组的调控机制。为探究大尿氨酸3-单加氧酶（KMO）及其产物8-羟基喹啉-2-羧酸（8-HQA）是否在甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）中发挥保守的菌群调控功能，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了kmo基因敲除突变体。研究发现，kmo缺失导致8-HQA合成受阻，破坏了肠道微生物稳态，促使肠球菌（Enterococcus）在肠道和口腔分泌物中过度增殖。突变体幼虫表现出生长迟缓、发育延迟，并对病原菌苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）的易感性显著增加。该结果揭示了大尿氨酸途径在连接宿主代谢、微生物组调控及幼虫适应性方面具有保守功能，强调了宿主遗传、菌群组成与环境胁迫间的互作关系。
昆虫的肠道并非一个无菌的通道，其中栖息着复杂多样的微生物群落，它们与宿主形成了紧密的共生关系。这些微小的“房客”不仅仅是过客，它们深度参与了宿主的营养吸收、免疫防御，甚至能帮助宿主应对来自植物的化学防御或病原菌的侵袭。在鳞翅目昆虫（如蛾类和蝶类）的幼虫阶段，其肠道结构相对简单，但越来越多的证据表明，其中存在一个相对稳定的核心微生物群，而肠球菌（Enterococcus）属的细菌常常是这个核心群落的优势成员。然而，一个根本性的科学问题随之而来：宿主自身是如何“管理”这些肠道微生物，维持其稳态，从而保障自身健康与适应能力的？
此前在近缘物种海灰翅夜蛾（Spodoptera littoralis）中的研究提供了一个有趣线索：宿主自身代谢通路——大尿氨酸途径（kynurenine pathway）中的一个关键酶，即大尿氨酸3-单加氧酶（KMO），可能扮演着“微生物管家”的角色。KMO催化的反应最终产生一种名为8-羟基喹啉-2-羧酸（8-HQA）的铁螯合物，它能被分泌到肠道中。研究发现，失去8-HQA会导致海灰翅夜蛾幼虫肠道细菌负荷增加、多样性下降。那么，这套由宿主代谢基因调控肠道菌群的机制，是否在夜蛾科昆虫中普遍存在？它对于昆虫在自然条件下的生长、发育以及对病原菌的抵抗力又意味着什么？
为了回答这些问题，一篇发表在《MicrobiologyOpen》上的研究，以另一种重要的农业害虫——甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）为模型，展开了深入探索。研究人员巧妙地利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功敲除了甜菜夜蛾的kmo基因，构建了稳定的突变体品系。他们系统比较了突变体与野生型幼虫在多个层面的差异：首先，利用液相色谱-串联质谱（LC-ESI-MS/MS）确认了突变体口腔分泌物中8-HQA的缺失；接着，通过对幼虫前肠、中肠、后肠以及口腔分泌物进行16S rRNA基因测序，精细刻画了肠道不同区段及口腔的微生物群落结构；最后，通过一系列生物学实验，评估了基因敲除对幼虫在人工饲料和辣椒叶片两种食料上的生长发育、存活率的影响，并重点测试了其对生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）的易感性变化。
本研究所采用的关键技术方法主要包括：1) CRISPR/Cas9基因编辑技术，用于构建甜菜夜蛾kmo基因敲除突变体品系；2) 液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（LC-ESI-MS/MS），用于检测和定量幼虫口腔分泌物中的8-HQA；3) 基于16S rRNA基因的代谢组学分析，分别使用RNA（针对肠道样本，以分析转录活跃的细菌）和DNA（针对口腔分泌物样本）来解析微生物群落的组成与多样性；4) 针对苏云金芽孢杆菌的商业制剂（Xentari）进行的生物测定，以评估幼虫的病原易感性。实验所用昆虫来自安德马特生物防治公司（Andermatt Biocontrol AG）提供的卵建立的实验室种群。
3.1 CRISPR-Cas9介导的kmo基因敲除及相关的色素表型改变
研究人员成功利用CRISPR/Cas9在甜菜夜蛾kmo基因的第三外显子引入突变，建立了稳定的kmo-/-纯合突变品系。突变体在多个发育阶段表现出显著的色素缺失表型：成虫复眼由黑色变为亮黄色，翅膀斑纹由深褐色变为金黄色；幼虫的单眼和脑组织则由深褐色变为透明/白色。这些变化与KMO在大尿氨酸途径中参与眼色素（ommochrome）合成的已知功能一致，证实了基因编辑的成功。
3.2 kmo-/-突变体口腔分泌物中8-HQA的缺失
通过LC-ESI-MS/MS分析，研究确认野生型甜菜夜蛾幼虫的口腔分泌物中含有8-HQA，而kmo-/-突变体的口腔分泌物中完全检测不到该化合物。这直接证明kmo基因的缺失阻断了8-HQA的生物合成。
3.3 kmo基因敲除对甜菜夜蛾细菌多样性的影响
对肠道不同区段（前肠、中肠、后肠）和口腔分泌物的微生物组分析表明，kmo基因敲除显著降低了细菌群落的丰富度（ASV richness）和香农多样性指数（Shannon index），这种效应在前肠和口腔分泌物中尤为明显。同时，定量PCR显示突变体中肠和前肠的16S rRNA转录本水平更高，提示细菌总负载量增加。
3.4 kmo基因敲除对甜菜夜蛾不同肠道区段细菌群落的影响
在野生型幼虫中，前肠、中肠和后肠的细菌群落具有明显的区室化特征，中肠的多样性最高。然而，在kmo-/-突变体中，这种区室化结构“坍塌”了，所有肠道区段的菌群变得相似，均类似于野生型的后肠群落，即以肠球菌（Enterococcus）为绝对主导。线性判别分析（LEfSe）进一步揭示，与野生型相比，突变体前肠和中肠中多种细菌属（如Cutibacterium、Staphylococcus、Lactobacillus等）的相对丰度显著降低，而Enterococcus的相对丰度则显著上升。
3.5 kmo基因敲除对甜菜夜蛾口腔分泌物细菌组成的影响
口腔分泌物的菌群分析也观察到了类似的变化。kmo-/-突变体的口腔菌群多样性降低，且几乎被一个特定的Enterococcus扩增子序列变异（ASV）所完全主导，而野生型中则由另外两个EnterococcusASV占据主要份额。这表明8-HQA的缺失不仅改变了肠道菌群，也深刻影响了口腔分泌物的微生物生态。
3.6 kmo-/-突变体幼虫发育与存活受损
生长发育实验发现，在人工饲料上，kmo-/-突变体幼虫达到的最大体重显著低于野生型，但发育时间差异较小。而在辣椒叶片（一种更具挑战性的自然食料）上饲喂时，突变体幼虫的死亡率显著升高，发育历期普遍延迟，从孵化到化蛹的总时间比野生型延长了2天以上。通过在人工饲料中补充8-HQA，可以部分缓解但未能完全挽回突变体的体重劣势。
3.7 kmo-/-突变体对苏云金芽孢杆菌的易感性增加
生物测定结果显示，kmo-/-突变体新生幼虫对苏云金芽孢杆菌（Bt）的商业制剂Xentari的敏感性约为野生型的3倍（LC50更低）。这表明，伴随着肠道菌群稳态的破坏，宿主对重要病原菌的抵抗力也显著下降。
该研究通过一系列严谨的实验，最终得出结论：在甜菜夜蛾中，宿主的大尿氨酸途径及其代谢产物8-HQA，对于维持肠道微生物稳态，特别是调控核心菌属——肠球菌（Enterococcus）的平衡，起着至关重要的作用。当这一途径因kmo基因敲除而中断时，会导致肠道菌群多样性丧失、区室化结构破坏，并引发Enterococcus的过度增殖。这种菌群失调进一步转化为宿主适应性代价：突变体幼虫在挑战性食物（辣椒叶）上生存率降低、发育延迟，并且对生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌（Bt）的易感性大幅增加。
在讨论中，作者将本研究结果与近缘物种海灰翅夜蛾的发现相联系，指出通过KMO-8-HQA轴调控肠道菌群（尤其是Enterococcus）的机制，可能在夜蛾科昆虫中是保守的。研究强调了肠道菌群稳态对宿主适应性的关键意义：在自然条件下，稳定的菌群有助于幼虫应对营养不均一的植物性食物；而当菌群失调，特别是机会致病菌过度生长时，会与Bt等病原菌协同作用，加剧宿主的病理反应，导致更高的死亡率。该研究不仅增进了我们对昆虫宿主-微生物共生互作机制的理解，也从新的角度揭示了昆虫生理状态、肠道微生态与病虫害防治效果之间的内在联系，为探索基于微生物组管理的害虫防控新策略提供了理论基础。
