《Carbohydrate Polymers》：Unveiling mechanistic insights of inactivated Aspergillus niger spore by fishery-waste-derived chitosan via synchrotron radiation tomography
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本研究首次利用同步辐射X射线显微技术，结合传统分析方法，阐明鱼ery废料来源壳聚糖抑制黑曲霉的机制。实验显示，2.0 g/L壳聚糖在6小时内实现6.05个数量级抑菌效果，通过三维显微成像揭示其诱导细胞壁破坏、细胞器萎缩及质膜解离，最终导致细胞不可逆崩溃的动态过程。
陈英辰|翁志煌|王春洁|林子静|黄尚明|吉尔玛·西萨伊·沃尔德|黄珍文|华莫大桑|林耀桐
台湾台中市国立中兴大学植物健康护理博士项目，邮编40277
摘要
黑曲霉（A. niger）是一种致病真菌，可引发严重甚至致命的侵袭性肺曲霉病。本研究首次利用基于同步辐射的X射线显微镜结合传统检测方法，阐明了源自渔业废弃物的壳聚糖（CTS）对A. niger的抗菌机制，实现了灭活过程的3D可视化。实验表明，浓度为2.0?g?L?1的CTS具有显著效果，在6小时内可使菌数减少6.05个对数级。透射X射线显微镜观察到孢子从球形转变为中心塌陷的结构；冷冻软X射线显微镜显示细胞器显著收缩、质膜脱离，6小时后细胞结构严重破裂，细胞体积从34.9?μm3降至6.5?μm3。原子力显微镜进一步显示细胞高度降低（从4.55?nm降至1.90?nm），表面粘附力增加（从0.72?nN升至2.21?nN），粗糙度增加（从3.51?nm升至13.03?nm）。荧光成像和钾泄漏检测证实离子大量流失，破坏了细胞渗透压平衡和稳态。综合这些结果，可知CTS通过质子化氨基与真菌表面的静电相互作用破坏细胞完整性，导致细胞质泄漏和不可逆的细胞内塌陷。本研究证实CTS是一种有效的基于碳水化合物的抗菌剂，并展示了同步辐射成像技术在接近自然条件下解析微生物抗菌机制的能力。
引言
侵袭性真菌感染（IFIs）每年影响多达300万人，导致高死亡率。此外，致病真菌还会造成严重的农业损失和食品安全风险（Firdaus等人，2024年；Rathee等人，2024年；Shende等人，2024年）。A. niger已成为一种关键病原体，据报道在需要机械通气的COVID-19患者中死亡率接近50%（Islam等人，2022年），其孢子吸入与哮喘、慢性肺病和曲霉病有关（Gomes等人，2024年；Usuda等人，2023年）。在农业领域，A. niger是水果黑斑病的主要诱因，导致采后腐烂和产量损失（Wei等人，2024年）。该菌的遗传稳定性和环境适应性使其能在恶劣条件下存活（Pan等人，2023年）。因此，亟需有效的灭活策略来保护公众健康和农业可持续性。
传统的三唑类杀菌剂（如泊沙康唑）仍是首选疗法，但耐药性的增加使得临床管理变得复杂并导致过度使用（Cai等人，2025年）。为应对这一挑战，人们研究了多种替代方案，包括金属衍生物（如银纳米颗粒、氧化铜纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒、氧化锌纳米颗粒和二氧化钛纳米复合材料），以及天然化合物（如橄榄叶、西瓜皮、香蕉皮）和植物提取物，这些物质因其良好的抗菌性能而受到关注。尽管这些材料具有抗菌活性，但其实际应用仍受限于较低的消毒效率、可能产生的有毒副产物以及对作用机制的 insufficient 理解。
壳聚糖（CTS）是一种天然多糖，由葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺单元组成，可从多种生物基质中提取，包括海洋甲壳类动物的外壳、昆虫外骨骼和真菌细胞壁（Rodríguez等人，2025年）。其中，虾壳因其较高的壳聚糖含量和优良的物理化学性质而特别有吸引力。虾壳壳聚糖的市场发展迅速，预计到2027年全球市场规模将达到约47亿美元（Pakizeh等人，2021年）。此外，虾壳的低灰分含量有助于壳聚糖的提取并提高其溶解度，使其比来自鱼类或蟹类副产品的壳聚糖更适合大规模生产（Kumari等人，2017年）。由于其无毒、生物相容性和抗菌活性，CTS被广泛应用于食品包装、制药、化妆品、伤口敷料和组织工程（Kong等人，2024年；Li等人，2024年；Saberi Riseh等人，2023年）。其抗菌作用主要归因于质子化氨基（NH?+）与带负电荷的微生物膜之间的静电相互作用，导致细胞结构破坏。此外，还有其他机制（如干扰DNA转录、抑制蛋白质合成和螯合必需离子）也被提出（Chaudhari等人，2023年；Hou等人，2025年）。尽管已有相关研究，但目前的研究仍受限于扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和荧光显微镜（FM）等传统显微技术的限制。传统电子显微镜只能提供破坏性的二维图像，穿透深度有限且对比度低，需要繁琐的样品处理步骤（如脱水、包埋、超薄切片和真空成像）。这些方法限制了我们对真菌细胞内部精细结构的全面了解，导致对灭活过程的解释不一致。一些研究报道细胞中部塌陷，而另一些研究则观察到细胞末端破裂。这种不一致性导致了对CTS在接近自然条件下抗菌机制的理解存在显著空白。
基于同步辐射的X射线显微镜为细胞成像提供了强大平台，可实现完整生物样本的高分辨率三维可视化。其中，透射X射线显微镜（TXM）和冷冻软X射线显微镜（SXM）特别适用于研究水合细胞。TXM结合快速投影匹配算法（Faproma）可无损识别三维超微结构，空间分辨率可达30?nm。SXM能在几微米厚的样品中保持纳米级分辨率（Peng等人，2020年），在“水窗”能量范围（284–543?eV或2.34–4.40?nm）内工作，无需化学染色或固定即可区分有机物和水分，从而保留细胞原始结构（Weinhardt等人，2020年）。冷冻处理还能减少伪影，断层重建可原位显示亚细胞成分的体积分布（Cossa等人，2022年；Zhu等人，2023年）。TXM和SXM的结合显著提升了我们在亚细胞分辨率下追踪微生物细胞结构和成分变化的能力。
本研究假设源自渔业废弃物的壳聚糖通过静电相互作用破坏黑曲霉孢子的细胞壁完整性，引发不可逆的细胞内塌陷和离子失衡。进一步假设这些在传统二维成像中难以观察到的体积超微结构变化，可通过基于同步辐射的X射线断层成像在接近自然条件下清晰显示。研究目标为：（i）评估壳聚糖对A. niger孢子萌发的时间依赖性抗菌效果；（ii）通过结合三维同步辐射成像（TXM和SXM）和传统生物物理方法（SEM、TEM、AFM和FM）阐明其抗菌机制。通过将抗菌效果与先进的结构成像技术相结合，本研究旨在提供超越传统模型的机制见解，证明CTS作为生物源抗菌剂的潜力，并展示先进同步辐射技术在微生物学研究中的应用价值。
部分内容摘录
虾壳壳聚糖的制备
虾壳（Litopenaeus vannamei）来自台湾台南县薛家区的一家当地水产养殖场。壳类经过彻底清洗、煮沸15分钟后用去离子水冲洗以去除表面杂质，然后浸入99%的丙酮中5分钟，并在80?°C下过夜干燥。干燥后的壳类被研磨成细粉以供进一步处理。壳聚糖的提取方法参照相关文献进行
表征
提取的壳聚糖的化学结构通过1H和13C核磁共振（NMR）光谱确定，如图2a-b所示。1H NMR谱显示了脱乙酰葡萄糖胺（GlcN）和残留N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）单元的特征信号，证实了该生物聚合物的部分脱乙酰性质。GlcN和GlcNAc的异头质氢核（H-1）分别位于约4.80?ppm和4.56?ppm处
结论
本研究证明，CTS通过多种机制（包括结构和生物物理变化）显著抑制A. niger孢子的萌发。CTS的抑制效果具有浓度依赖性（0.75–2.00?g?L?1?1浓度下6小时内可使菌数减少6.05个对数级。全面的形态学和物理化学分析表明，CTS处理会导致真菌细胞壁逐渐变形
作者贡献声明
陈英辰：撰写——原始稿件、方法学设计、实验实施、数据分析。翁志煌：撰写——审稿与编辑、数据管理。王春洁：撰写——审稿与编辑、数据管理。林子静：撰写——审稿与编辑、数据管理。黄尚明：撰写——审稿与编辑、数据验证。吉尔玛·西萨伊·沃尔德：撰写——审稿与编辑、数据验证。黄珍文：撰写——审稿与编辑、数据验证。华莫大桑：数据管理。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家同步辐射研究中心（NSRRC-2025-1-132-1）、国家科学技术委员会（资助编号：114-2218-E-005-005-005、112-2221-E-005-021-MY3、111-2621-M-005-001、110-2621-M-005-001、109-2218-E-005-006、108-2221-E-005-048-MY3、108-2218-E-005-004、107-2218-E-005-007、106-3114-E-005-003、106-2218-E-005-011-MY2）以及台湾壳聚糖协会的支持。
