《European Journal of Plant Pathology》：A Gerbox-based minisett method for in vitro assessment of pineapple disease in sugarcane
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本文介绍了一项针对甘蔗菠萝病（由Thielaviopsis spp. 引起）的生防新策略研究。为解决化学防治局限及生防菌株筛选方法缺乏的问题，研究人员开发了一种基于Gerbox容器和小种茎（minisett）的离体评估方法，并将其用于筛选木霉（Trichoderma spp.）菌株。结果表明，该方法是可重复且高效的，所测试的T. afroharzianum菌株能显著降低病害严重度（高达93.06%）。这为菠萝病的生防剂初步筛选提供了有力工具，具有重要的应用潜力。
甘蔗，这种为世界提供大量食糖和生物能源的巨型禾草，其种植产业正遭受一种“水果病”的困扰。这种被形象地称为“菠萝病”的病害，并非由菠萝引起，而是由一类名为Thielaviopsis（根串珠霉属）的土壤习居真菌侵染甘蔗种茎（setts）所致，其病组织会散发出类似菠萝的发酵气味。在巴西这个全球最大的甘蔗生产国，该病害是种苗健康的重要限制因素，可导致萌芽率降低高达50%，造成显著的经济损失。当前，病害管理严重依赖化学药剂浸种，但存在防治效果不稳定、成本高及潜在环境风险等问题。在生物防治方面，巴西仅登记了一个Trichoderma harzianum（哈茨木霉）菌株的产品可用，凸显了寻找新生物防治替代品的迫切性。更关键的是，现有筛选生防菌株的常规方法（如平板对峙培养）难以模拟病原菌在甘蔗种茎上的真实侵染过程，缺乏标准化的、能更贴近田间感染条件的离体评估方法，这制约了具有实际应用潜力菌株的筛选效率。为了破解这一困境，研究人员开展了一项研究，旨在开发并验证一种基于甘蔗小种茎（minisetts） 和Gerbox（一种塑料培养盒）系统的菠萝病离体评估方法，并演示该方法在筛选潜在生防菌剂（以T. afroharzianum菌株为例）中的适用性。该研究最终证实，所建立的方法是一种可重复且有效的菠萝病离体评估工具，在生防剂的初步筛选中具有应用潜力。相关研究成果已发表在植物病理学领域的专业期刊《European Journal of Plant Pathology》上。
为了开展这项研究，作者主要采用了以下几种关键技术方法：首先是病原菌鉴定，通过对Thielaviopsis菌株进行形态学特征观察，并结合翻译延伸因子1-α (tef1-α) 基因的部分测序与系统发育分析，明确了其物种身份。其次是建立了核心的离体（in vitro） 生物测定方法，即“Gerbox-based minisett”法。该方法使用甘蔗品种RB867515的小种茎，经过表面消毒后，先用不同木霉（Trichoderma） 菌株的孢子悬浮液（浓度107孢子 mL-1）进行浸渍处理（模拟生防菌应用），随后置于铺垫湿润滤纸的Gerbox中，再在种茎切口（病原菌主要侵染位点）喷洒接种Thielaviopsis ethacetica孢子悬浮液（浓度105孢子 mL-1），密封后在28°C下培养21天。最后是病害评估与数据分析，培养结束后纵向剖开种茎，依据内部组织变暗的百分比采用5级严重度标准进行评分，计算麦金尼病指（Disease Index, DI） 进行描述性分析，并运用阿马拉尔侵染强度角指数（ω） 对数据进行转换以满足方差分析前提，进而比较不同处理间的差异显著性。
结果部分：
1. Thielaviopsis菌株的鉴定
通过形态学观察，该菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上初期产生白色菌丝，随后迅速变黑，可产生两类分生孢子：无色、圆柱形的内生分生孢子（endoconidia）和棕色、厚壁的阿勒里分生孢子（aleurioconidia）。分子鉴定方面，基于tef1-α基因序列进行的BLASTn比对和贝叶斯系统发育分析均表明，该菌株与Thielaviopsis ethacetica的参考序列聚为一支，并获得最大后验概率支持，从而确定其为T. ethacetica（巴西甘蔗菠萝病的病原菌之一）。
2. 基于Gerbox-小种茎法的菠萝病离体评估
所建立的离体方法能清晰区分不同处理对病害的抑制效果。描述性分析显示，经T. afroharzianum菌株NPF10、NPF12和NPF16处理的小种茎病害严重度最低，平均病指仅为2.92%，相比只接种病原菌的阳性对照，病害减轻了93.06%。菌株NPF30和NPF33表现出中等防效，而基于T. harzianum的商品化处理病害最重，病指达55.83%。病害严重度的热图可视化结果直观地呈现了各处理间的差异。同时，代表不同严重度等级的种茎剖面照片为评估提供了直观的视觉标准。
3. Gerbox-小种茎法的统计学验证
基于ω指数进行的方差分析表明，不同处理对病害强度存在极显著影响。事后比较（Tukey检验）显示，T. harzianum商品制剂处理与仅接种病原菌的阳性对照具有最高的ω值，且两者无显著差异，表明病害强度高。相反，所有T. afroharzianum菌株（NPF10, NPF12, NPF16, NPF30, NPF33）处理以及与无菌水阴性对照的ω值均显著低于上述两组，证明了这些菌株处理能有效降低病害强度。该统计结果确认了所建立的方法能够可靠地区分出生防潜力不同的处理。
结论与讨论：
本研究成功地将引起甘蔗菠萝病的病原菌鉴定为Thielaviopsis ethacetica。更重要的是，研究开发并验证了一种基于Gerbox容器和甘蔗小种茎的离体评估方法，用于模拟和评估菠萝病的发生与防治。该方法相比传统的平板对峙法，能更好地模拟病原菌通过种茎切口侵染的自然过程，以及生防菌与病原菌在寄主组织上的相互作用，为在可控条件下初步筛选生防剂提供了更贴近实际的平台。应用该方法对五株巴西本土T. afroharzianum菌株的测试表明，其中三株（NPF10, NPF12, NPF16）表现出优异的病害抑制潜力，效果显著优于目前登记使用的T. harzianum商品制剂，这凸显了筛选特定、高效生防菌株的重要性，也展示了T. afroharzianum作为生防资源的潜力。研究流程图直观展示了该方法的完整操作步骤。其实验关键步骤，如生防菌与病原菌的孢子制备、小种茎浸渍、接种及培养等，均有明确的图片记录。
该研究的意义在于，首先，它填补了甘蔗菠萝病缺乏标准化、贴近田间感染的离体评估技术的空白，为植物病理学研究提供了一个可重复、高效的方法学工具。其次，该方法能够有效区分不同微生物处理的防治效果，非常适合用于大批量潜在生防菌株或制剂的初步筛选（preliminary screening） ，可大大提高筛选工作的效率和针对性，降低直接进行田间试验的成本与风险。最后，研究结果再次强调了生物防治作为化学防治可持续替代方案的潜力，特别是挖掘和利用本地适应的T. afroharzianum等生防资源，对于构建甘蔗病害的绿色综合治理策略具有重要意义。当然，作者也谨慎指出，离体条件下的优异表现仍需通过温室和田间试验进一步验证，以评估这些生防菌剂在实际农业环境中的稳定性、持效性及其与综合管理措施的兼容性。
