通过整合代谢和蛋白质工程在大肠杆菌中重新合成3′-唾液酸乳糖胺

《Bioresource Technology》：De novo biosynthesis of 3′-sialyllactosamine in Escherichia coli via integrated metabolic and protein engineering

本研究建立了一种基于定向进化的α2,3-唾液酸转移酶BtM2的从头生物合成途径，通过CRISPR-Cpf1整合关键基因并优化UTP供应，显著提高大肠杆菌BL21(DE3)中3'-SLN的发酵产率达14.23 g/L，并减少中间产物积累。

　　

罗国聪|黄兆林|张文博|朱英英|张文莉|穆婉萌

江南大学食品科学与技术学院食品科学与资源国家重点实验室，中国江苏省无锡市214122

摘要

人类母乳寡糖（HMOs）的微生物生产引起了越来越多的关注；然而，作为唾液酸Lewis X关键前体的3′-唾液酸乳糖胺（3′-SLN）的高效生物合成仍然很大程度上尚未被探索。在这项研究中，通过在大肠杆菌 BL21(DE3)中协调N-乙酰乳糖胺的形成、CMP-N-乙酰神经氨酸的供应以及末端α2,3-唾液酸化作用，建立了一条从头生物合成途径。来自Bibersteinia trehalosi的α2,3-唾液酸转移酶通过AlphaFold引导的饱和突变得到了优化，产生了一个改进的变体BtM2，该变体提高了3′-SLN的产量，从而进一步改善了途径的通量。利用CRISPR-Cpf1系统实现了关键生物合成基因的多拷贝染色体整合，同时增加了尿苷5′-三磷酸的可用性，以增强激活的唾液酸生物合成。通过结合蛋白质和代谢工程，最终工程菌株实现了高效的3′-SLN生产，在分批发酵中的产量达到了14.23克/升。这项工作展示了一种实用的微生物策略用于3′-SLN的生物合成，并扩展了生产唾液酸化HMOs的工具箱。

引言

HMOs是母乳中第三大固体成分，仅次于乳糖（55–70克/升）和脂质（16–39克/升）（Luo等人，2023年）。尽管HMOs不是婴儿的直接能量来源，但它们通过调节肠道微生物组成、防止病原体附着和支持免疫系统成熟发挥关键生物作用（Soyy?lmaz等人，2021年）。迄今为止，已经鉴定出200多种结构不同的HMOs，它们都来源于五种常见的单糖单元：d-葡萄糖（Glc）、d-半乳糖（Gal）、N-乙酰-d-葡萄糖胺（GlcNAc）、l-岩藻糖（Fuc）和N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）。

在这些HMOs中，唾液酸化乳糖寡糖（SMOs）构成了一个功能重要的亚组，包括3′-唾液酸乳糖（3′-SL）、6′-唾液酸乳糖（6′-SL）、3′-唾液酸乳糖胺（3′-SLN）和6′-唾液酸乳糖胺（6′-SLN）（Oliveros等人，2018年；Wang等人，2021年）。这些唾液酸化糖类优先刺激有益的双歧杆菌物种的增殖，并作为可溶性糖类模拟物拦截病原体-宿主相互作用，从而有助于肠道稳态和宿主防御（Garrido等人，2015年；Perdijk等人，2019年）。在SMOs中，3′-SLN（Neu5Acα2,3Galβ1,4GlcNAc）是一种结构明确的三糖，在天然来源中的含量较低，据报道在牛乳中的含量约为50毫克/千克（Jiao等人，2025年）。尽管其结构与3′-SL非常相似，但3′-SLN表现出不同的生物功能，并且是细胞表面糖缀合物上常见的α2,3-连接的唾液酸化表位的代表。值得注意的是，α2,3-连接的唾液酸化糖类在人类下呼吸道中含量丰富，在流感病毒附着和宿主特异性中起着关键作用（Dedola等人，2024年；Shinya等人，2006年；Zhu等人，2023年）。然而，3′-SLN在自然界中的有限可用性限制了其功能研究和转化应用，突显了需要高效且可扩展的合成或生物合成生产策略。

鉴于3′-SLN的商业相关性日益增加，人们投入了大量努力来开发高效的合成策略。已有报道使用酶法生产3′-SLN的方法；例如，Jiao等人（2025年）建立了一个优化的体外系统，当使用市售的N-乙酰乳糖胺（LacNAc）作为受体底物时，转化产率超过了95%。尽管酶法和化学合成方法效率很高，但它们受到昂贵底物需求或环境不友好工艺的限制。相比之下，微生物合成通过利用甘油或葡萄糖等廉价碳源在温和的发酵条件下提供了一种更可持续的替代方案。因此，越来越多的关注集中在3′-SLN的微生物生产上。最近，Luo等人（2026年）报道了一种基于回收途径的3′-SLN生物合成策略，通过外部补充Neu5Ac，在工程菌株中实现了7.75克/升的3′-SLN产量。

唾液酸化HMOs的回收合成途径依赖于neuA（CMP-Neu5Ac合成酶）和Btα2,3SiaT的同源表达，以及外部补充Neu5Ac。相比之下，从头生物合成途径在实践和科学上更具吸引力，因为它们利用廉价且工业上易获得的碳源（如甘油和葡萄糖），并且无需补充Neu5Ac。因此，目前的唾液酸化HMOs的微生物生产主要通过从头途径实现（表1）。该表列出了宿主菌株、产生的HMO类型、所采用的基因修饰、分批发酵产量和生产力。在唾液酸化HMOs中，3′-SL的研究最为广泛，据报道在大肠杆菌 BL21 star（DE3）中通过组合敲除多个竞争途径和过表达neuBCA、glmUMS和nST，实现了56.8克/升的最高产量（Lv等人，2024年）。其他关于3′-SL的研究报道的产量范围为32.1至44.2克/升，生产力在0.68至0.53克/升/小时之间（Zhang等人，2024年；Li等人，2024年）。对于6′-SL，在工程大肠杆菌 DH5α中获得了高达30.18克/升的产量（Liu等人，2025a），而Zhu等人（2025年）在大肠杆菌 MG1655中使用另一种从头途径（涉及GNA1、AGE和α2,6-唾液酸转移酶）实现了14.33克/升的产量。还生产了更复杂的唾液酸化HMOs，如唾液酸乳糖-N-四糖a（LST-a）和唾液酸乳糖-N-四糖c（LST-c）。LST-a的最高产量分别为8.178克/升（Lin等人，2025年）和4.85克/升（Sheng等人，2025年），而LST-c达到了9.745克/升（Liu等人，2025b）。最近，Luo等人（2026年）报道了一种基于回收途径的3′-SLN生产策略，通过补充Neu5Ac实现了7.75克/升的产量。这些研究通常涉及糖转移酶基因的多拷贝整合和核苷糖前体途径的精细调整。在这项研究中，我们建立了一条从头的3′-SLN生物合成途径，在分批发酵中实现了14.23克/升的产量。与基于回收途径的策略相比，从头方法实现了更高的产量，并显著减少了中间体LacNAc的积累。

在这里，对大肠杆菌 BL21(DE3)菌株进行了工程改造，以实现3′-SLN的高效生物合成。首先通过比较AGE和neuC依赖的CMP-Neu5Ac生物合成途径构建了一个初始的3′-SLN生产平台。在AlphaFold3引导的结构分析指导下，通过靶向饱和突变合理工程化了关键限速酶Btα2,3SiaT，得到了一个改进的变体BtM2，显著提高了体内3′-SLN的形成。为了进一步增加途径通量，使用CRISPR-Cpf1系统实现了neuBCA和BtM2的多拷贝染色体整合。此外，通过整合cmk基因增加了尿苷5′-三磷酸（UTP）的可用性，从而增强了CMP-Neu5Ac的供应。这些模块的协调优化不仅提高了3′-SLN的产量和生产力，还减少了细胞内中间体LacNAc的积累。所得菌株ESLN15在生物反应器条件下进行了评估，在分批发酵中实现了14.23克/升的3′-SLN产量，证明了整合的代谢和蛋白质工程策略的有效性。

部分摘录

微生物、培养条件和质粒

本研究中使用的所有微生物菌株均列于表2中。质粒构建策略、培养基配方和定义的培养条件均改编自先前的方法（Luo等人，2025年）。引物和质粒的详细信息见表S1和S2。

对于3′-SLN的瓶规模生产，将工程菌株在添加了适当抗生素的4毫升LB培养基中于37℃下进行培养，并进行搅拌。

在工程大肠杆菌 BL21 (DE3)中组装3′-SLN的从头生物合成途径

使用了一种先前开发的大肠杆菌菌株作为构建3′-SLN生产菌株的底盘。由于LacNAc是α2,3-唾液酸化的直接受体底物，因此稳定的高效LacNAc生物合成是下游3′-SLN生产的前提。在我们之前的工作中，通过删除lacZ、nagB、nagA、ldhA和nanE，并整合了来自大肠杆菌的单拷贝glmS^?（葡萄糖胺-6-磷酸合成酶）来对大肠杆菌进行代谢工程改造

结论

在这项研究中，通过整合代谢途径构建、酶工程和基因组级优化，在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功建立了一个从头微生物平台用于3′-SLN的生物合成。关键α2,3SiaT的鉴定和结构导向优化显著提高了末端唾液酸化步骤的效率，而途径基因的多拷贝染色体整合和辅因子工程进一步改善了向3′-SLN的代谢通量。

CRediT作者贡献声明

罗国聪：撰写——原始草稿、方法学、研究。黄兆林：可视化、研究。张文博：撰写——审阅与编辑、项目管理。朱英英：撰写——审阅与编辑。张文莉：撰写——审阅与编辑、项目管理。穆婉萌：撰写——审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家重点研发计划（2025YFC3409500）、食品科学与资源国家重点实验室的研究计划（编号SKLF-ZZB-202501）以及中央高校基本科研业务费（JUSRP202501141）的支持。我们感谢Home for Researchers编辑团队（www.home-for-researchers.com）提供的语言编辑服务。