《Current Opinion in Chemical Biology》：Proximity labeling tools for studying chromatin interactomes
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本文系统综述了基于PL（Proximity Labeling）技术解析染色质微环境的最新进展，重点聚焦于蛋白质中心（如H3K9cr、H3K79me）及核酸中心（CRISPR-dCas9、G4、R-loop）的互作网络，为表观遗传调控及疾病靶点发现提供了强大工具。
Introduction
染色质作为细胞核内高度压缩的动态结构，其内部的蛋白质-核酸相互作用一直是生命科学研究的难点。传统的免疫共沉淀（Co-IP）技术因依赖于细胞裂解，极易破坏由核酸或脂质支架介导的瞬时互作，难以还原真实的染色质环境。邻近标记（Proximity Labeling, PL）技术的出现突破了这一瓶颈。该技术通过在活细胞中将酶或催化剂靶向至目标“诱饵”（Bait），原位生成活性中间体，对邻近分子进行共价标记，再通过质谱分析，实现了在原生细胞环境下对染色质相互作用组的高时空分辨率解析。
Protein centered PL
组蛋白是染色质的核心组分，其独特的翻译后修饰（PTM）和变异构成了复杂的调控微环境。针对组蛋白的PL技术面临两大挑战：一是需要可控的标记半径以区分相邻核小体的独特微环境；二是需要特异性识别特定PTM以解析修饰依赖的互作网络。近年来，基于合成光催化剂和酶系统的PL平台在空间精度和PTM特异性方面取得了显著进展。
Spatially precise chromatin interactome mapping
在空间精度方面，光催化PL平台展现出独特优势。其中，μMap平台利用铱（Ir）光催化剂通过split intein系统定点整合到组蛋白上，在蓝光激活下生成卡宾自由基，实现了<4 nm的超高空间分辨率标记。该技术成功应用于分离的细胞核，精确绘制了染色质微环境，并揭示了DOT1L抑制剂pinometostat处理后H3K79甲基化相关复合物的丢失及转录失活状态。在此基础上发展的MesoMap平台，通过将光催化剂分布到多个组蛋白上，实现了染色质尺度的全局标记，能够监测HDAC抑制剂Romidepsin诱导的乙酰化阅读器招募及甲基化复合物置换等系统级动态变化。然而，这些方法目前仍受限于重组肽合成及核分离步骤对染色质天然状态的潜在影响。
PTM-specific chromatin interaction profiling
在PTM特异性方面，抗体导向和遗传密码扩展策略提供了有力工具。ChromID利用工程化的染色质阅读器融合BASU生物素连接酶进行标记，但存在标记时间过长（达12小时）的问题。更先进的ProtA-TurboID和AMAPEX方法采用TurboID或APEX2与Protein A的融合蛋白，结合特异性抗体，实现了对特定PTM标记组蛋白（如H3K9me3）的“即用型”邻近标记，无需遗传操作，适用于复杂样本。需要注意的是，这些方法可能通过trans方式标记相邻核小体上的阅读器，需控制探针浓度以避免饱和靶点。此外，结合遗传密码扩展技术，研究者构建了APEX2–H3K9cr融合蛋白，在活细胞中特异性识别H3K9位点的巴豆酰化（crotonylation），并成功鉴定出DPF2等新型相互作用因子，尽管该技术对正交翻译系统的构建和优化要求较高。
Nucleic acid-centered PL
核酸中心的邻近标记技术将研究视野扩展到了基因组特定位点、特定RNA以及非经典核酸结构（如R-loop和G-四链体）。
Genomic loci
针对基因组特定位点的蛋白质组成分析，早期方法如CasID、GloPro等受限于酶活性或细胞毒性。新一代快速生物素连接酶TurboID和UltraID的出现显著提升了标记效率。TurboCas（dCas9-miniTurbo）和CasUltra（dCas9-UltraID）系统能够靶向单拷贝基因组位点（如MYC启动子），在短时间内捕获调控因子，并揭示JQ1等小分子药物引起的互作变化。然而，dCas9系统的脱靶效应、未结合融合酶的高背景以及内源性ATP/生物素的干扰仍需谨慎优化。PROBER平台则通过将标记机器招募到高拷贝数的附加体底物上，有效放大了信号，克服了染色体位点标记密度低的限制。
RNA species
RNA中心的PL技术主要利用CRISPR-RNA靶向或杂交探针策略。CRISPR-based RNA PL（dCas13-TurboID/APEX2）能够靶向特定RNA（如NEAT1、XIST），揭示相分离凝聚体中的蛋白质组成。HyPro/HyPro2和O-MAP等技术则利用地高辛（DIG）标记的反义探针或FISH-like探针，通过HRP介导的生物素化，在近生理条件下绘制RNA-蛋白质相互作用图谱，为研究核斑点和 paraspeckle等亚核结构提供了新视角。
Noncanonical nucleic acid structures
非经典核酸结构（如G-四链体和R-loop）的PL研究揭示了独特的调控机制。G4PID利用G-四链体结合域RHAU23融合miniTurbo，在活细胞中鉴定了与端粒维持和转录调控相关的G4结合蛋白。光催化μMap技术也被应用于端粒G4结构，实现了邻近蛋白质的共价标记。此外，RNase H1杂交结合域融合APEX2或TurboID能够选择性标记R-loop相关蛋白，揭示了R-loop在DNA损伤修复和神经发育中的调控网络。
Concluding remarks
邻近标记技术正在重塑染色质生物学的研究范式。未来该领域的发展将集中于开发更小、更高效的酶标签（如UltraID），优化光催化系统的组织穿透深度（如红光/近红外光），并推动多组学整合（如μMap-seq同时绘制蛋白质和转录组）。尽管在标记特异性、背景控制以及复杂样本应用方面仍存在挑战，但这些工具无疑将为解析染色质调控机制和开发相关疾病疗法提供前所未有的洞察力。
