《Current Opinion in Chemical Biology》：Recent advances in mapping protein networks regulated by post-translational modifications via proximity tagging
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本综述（2023-2025）系统评述了利用邻近标记（PL）技术绘制翻译后修饰（PTM）调控的蛋白质相互作用网络（PPIs）的最新进展，涵盖乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、氧化还原敏感的Cys网络及糖基化。文章重点介绍了μMap、ProLORT、SelectID、Ub-POD、Cys-LoC/LOx、GAP–MS等一系列创新技术平台，它们通过酶促或光催化策略，实现了对动态、瞬时、低化学计量比的PTM特异性相互作用的高时空分辨率映射。这些进展正推动PTM感知的互作组图谱从描述性研究转向基于机制、可指导药物发现的功能框架。
基于邻近标记技术解析翻译后修饰调控的蛋白质网络研究进展
引言
蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）是细胞生物学的核心，调控信号传导、分子运输和功能大分子复合物的组装，这些过程可被翻译后修饰（PTMs）动态调控。这些相互作用网络构成了一个“相互作用组”，即在标记时刻，围绕特定“诱饵”（蛋白、基因位点、细胞器或PTM状态）形成的、具有环境特异性的蛋白质邻域。不同的PTM修饰（由“书写者”添加，“擦除者”去除，“阅读者”解读）为每个网络增加了额外的组织复杂性。乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、氧化还原调节的半胱氨酸网络和糖基化塑造了随亚细胞空间变化的互作组连接。关键的是，PTMs本质上是动态的，其安装和移除具有不同的动力学特征，因此邻近蛋白的存在取决于标记发生的时间和地点。传统的下拉方法难以绘制这些瞬态、动态且通常是低化学计量比的事件，尤其是在细胞核内，纳米级的组织和快速重塑使挑战加剧。
快速兴起的酶促和光催化邻近标记（PL）策略通过将局部邻域转化为可经液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）检索的共价记录，解决了这些限制。酶促PL（例如APEX2、TurboID）产生能在约>10纳米范围内标记邻近蛋白的活性中间体，而光催化PL产生的活性物种则将标记限制在更小的半径内（<10纳米）。在时间上，APEX2（一种工程过氧化物酶）可实现秒级标记脉冲，TurboID（一种工程生物素连接酶）在数分钟到数小时内标记邻近蛋白，而光催化PL平台则提供光门控的秒级标记。将这些策略与化学扰动（从分子胶、诱导接近的化学诱导剂，到复合体限制性共价配体）相结合，可以捕获特定的PTM组装状态及其相应的互作组变化。化学诱导接近（CIP）是一种补充策略，它利用基于小分子的机制性扰动来重写特定的接触，从而揭示原本隐秘的通路。
染色质PTM互作组图谱
染色质因其固有的PTM状态和纳米级组织，需要精确、时间敏感的标记，这对PL提出了严格考验。由MacMillan课题组开发的μMap是一种光催化PL平台，它通过蓝光（450纳米）激发固定的铱（Ir）光催化剂，通过Dexter能量转移敏化一种细胞通透性的重氮丙啶探针，从而在指定目标周围创建纳米尺度的“足迹”。由此产生的短寿命卡宾活性中间体在毫秒时间尺度上插入约4纳米内的邻近蛋白，安装可被LC-MS/MS检索的共价标签。与Muir课题组开发的核内蛋白质反式剪接技术相结合，μMap可被安装到组蛋白H3.1等核内靶标上，以报告与特定染色质状态相关的互作组。MesoMap将μMap策略从单一诱饵扩展到染色质范围覆盖，通过将μMap光催化剂选择性地分布到多个锚点。重要的是，MesoMap捕获了组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制如何重塑染色质邻近网络，将酶促PTM扰动与空间组织的互作组重塑联系起来。
乙酰化和去乙酰化形成短暂接触，常规避常规PL。张（Zhang）课题组近期引入的ProLORT通过将APEX2与HDAC8融合来解决这一问题。加入过氧化氢和生物素-苯酚后，APEX2产生生物素-苯氧自由基，标记邻近的HDAC8蛋白。一个正交的富集“陷阱”进一步增强了邻近蛋白富集的选择性，它通过将可光交联的氨基酸编码到HDAC8中，实现对邻近底物的共价标记。重要的是，ProLORT发现了CTTN（皮质肌动蛋白）作为一个新靶点，说明了短暂的标记窗口如何揭示瞬时的乙酰化网络。
甲基化是另一个调节基因表达和基因组稳定性的关键修饰，但绘制特定甲基化位点的蛋白质图谱一直具有挑战性。Qian等人近期报道了SelectID的开发，它将催化死亡的Cas9与生物素连接酶（dCas9-TurboID）融合，并与一个甲基化DNA结合模块结合，以标记5-甲基胞嘧啶（5-mC）修饰的基因组位点的蛋白质。在生物素存在下，TurboID产生生物素-5'-AMP，一种可标记邻近蛋白的活性中间体。应用于重复元件，SelectID鉴定出CHD4是转录活性LINE-1的潜在抑制因子，其通过结合LINE-1的5'UTR启动子区域发挥作用，展示了在活细胞中对甲基化染色质相关互作组进行位点靶向、PTM分辨的发现。
磷酸化与磷酸酶/激酶图谱绘制
磷酸化是一种可以重写PPIs的动态PTM，识别负责的激酶和磷酸酶底物仍然是一项重要任务。为了在接近生理水平下绘制磷酸酶底物图谱，Tonks课题组将底物捕获突变与生物素连接酶邻近标记相结合。在此策略中，BirA生物素连接酶从生物素产生生物素-5'-AMP，在约10纳米内共价标记邻近蛋白。BirA与一个催化死亡但保留结合能力的突变型蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）融合，该突变体保留底物的时间足以进行共价标记和LC-MS/MS鉴定，而无需强制稳定，从而保留了天然的酶-底物环境。应用于HER2阳性和曲妥珠单抗耐药的乳腺癌细胞，该策略提名了PTP1B互作组中先前未知的伙伴。为了扩展底物覆盖范围，PEPSI（PUP-IT增强的蛋白酪氨酸磷酸酶底物鉴定）将底物捕获与PUP-IT肽转移标记相结合，实现了对PTPs周围邻居的持久标记。张（Zhang）等人通过分析SHP1底物展示了PEPSI方法，并鉴定出THEMIS是一个先前未被识别的底物，将SHP1邻近性与T细胞受体信号输出联系起来。
泛素化：泛素化位点分析与去泛素化酶（DUB）邻近性图谱
泛素化是一种可逆的PTM，调节蛋白质稳定性、运输和信号传导。泛素（Ub）-酶（例如E3连接酶）和去泛素化酶（DUB）底物通常形成瞬时的、环境特异性的接触，使得互作组图谱成为捕获动态泛素依赖性互作组的理想技术。泛素特异性PL通过将生物素连接酶BirA与E3连接酶基因融合，并提供生物素-受体标记的泛素，将生物素化集中在E3泛素连接酶底物相互作用上。在生物素存在下，BirA驱动BAP标记的泛素发生生物素化，然后生物素化的泛素被转移到邻近的E3底物上。最近的三个实施方案——BioE3、E-STUB和Ub-POD——证明了该策略能够以高特异性提名E3连接酶底物，支持靶向蛋白质降解剂应用和通用底物图谱绘制。
为了以位点水平的细节解析去泛素化酶（DUB）邻近事件，Kessler课题组开发了一个邻近泛素组学工作流程，将APEX2 PL与diGly（K-ε-GG）泛素化富集相结合。一个APEX2标记的DUB生物素化邻近蛋白，在胰蛋白酶消化后，使用抗K-ε-GG抗体捕获带有K-ε-GG的肽段，以识别邻近泛素化位点。应用于USP30时，该策略检测到局部泛素化的变化，并提名LETM1为候选底物，将DUB邻近性与功能性泛素重塑联系起来。
半胱氨酸氧化还原网络与邻近性图谱
半胱氨酸残基经历可逆的共价修饰，可作为氧化还原开关，重写局部相互作用网络。Backus课题组的最新发展将TurboID PL与氧化还原状态感知的化学蛋白质组学相结合，通过Cys-LoC（半胱氨酸局部捕获）和Cys-LOx（半胱氨酸局部氧化）来表征“半胱氨酸组”。在Cys-LoC中，TurboID在定义的亚细胞区室内生物素化邻近蛋白，同时用碘乙酰胺炔烃（IAA）封端半胱氨酸。随后通过点击化学将IAA标记的肽段与生物素-叠氮化物连接，实现对位点特异性生物素化半胱氨酸肽段的捕获。Cys-LOx类似地利用TurboID进行空间锚定（例如在线粒体内）和邻近蛋白的生物素化，但用同位素标记的轻链（IPIAA-L）和重链（IPIAA-H）异丙基IAA探针封端还原型半胱氨酸，IPIAA-L与IPIAA-H的比值报告每个位点的氧化状态。总之，这些策略以亚细胞背景绘制半胱氨酸丰度和氧化图谱，并报告氧化还原变化位点以及邻近共定位的伙伴。
糖基化：蛋白质锚定图谱与糖型依赖性读出
糖基化是一种关键的PTM，塑造免疫、信号传导、运输和蛋白质稳定性，但其组合复杂性以及缺乏基因组模板，使得糖基化依赖性互作组图谱绘制具有独特的挑战性。酶促PL可实现与糖蛋白或聚糖结合模块的融合，以标记活细胞中的邻近伙伴。光催化PL提供了一种互补的、具有纳米级标记半径的光门控方法，用于糖基感知测量。
我们一直在使用APEX2来解析聚糖结合蛋白的互作组，这些蛋白由于其弱和瞬时的结合特性，传统上难以被发现。最近，我们开发了一种APEX2-FGF2融合蛋白，以实现FGF2互作组的图谱绘制，突出了其糖胺聚糖依赖性蛋白伙伴，并说明了APEX2催化的邻近标记能够揭示逃避传统下拉方法的蛋白聚糖介导的相互作用。额外的硫酸肝素扰动（例如肝素竞争或酶消化）进一步验证了糖胺聚糖依赖性。
与生物素转移PL互补，邻近氧化策略可以通过局部化学足迹揭示聚糖-蛋白质相互作用。Xie等人引入了岩藻糖环境的蛋白质氧化（POFE），其中细胞用合成叠氮岩藻糖手柄进行代谢标记，该手柄与FeBABE自由基发生器结合。过氧化氢介导的羟基自由基生成氧化标记岩藻糖附近的氨基酸残基。利用氧化特征，重建了Galectin-3和Galectin-3结合蛋白的岩藻糖介导的相互作用网络，证明POFE可以识别新的岩藻糖结合伙伴。
表皮生长因子受体（EGFR）是一种高度N-糖基化的跨膜糖蛋白，其聚糖组成可调节不同的生物学功能。为了解析EGFR的互作组，Seath及其同事开发了一种红光PL平台，它将硫鎓重氮探针与单线态氧生成（SOG）光催化剂结合。在实践中，EGFR用西妥昔单抗-二氢卟酚e6 SOG光催化剂（Ce6）偶联物靶向，红光（～660纳米）激发Ce6导致EGFR邻近蛋白标记。并行实施了使用硫鎓重氮探针的双卡宾策略，实现了EGFR互作组的多范围标记。总之，SOG光催化和卡宾标记提供了一种互补的、糖基化感知的途径来分析糖蛋白互作组，并且可以相对于仅基于卡宾的策略扩展覆盖范围。
Xu等人探索了使用N-乙酰半乳糖胺基转移酶-3（GALNT3）与TurboID的融合蛋白来绘制GALNT3互作组，揭示了邻近的O-糖基化伙伴。GALNT3通过将N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）连接到蛋白质上启动O-连接糖基化，这一过程通常被认为主要存在于分泌途径中。值得注意的是，许多GALNT3相关蛋白是核内组织的，表明O-GalNAc修饰或GALNT3相关复合物也可能存在于核区室中。
糖工程重塑了细胞或蛋白质表面聚糖的组成和分布，并最近成为研究糖基化依赖性互作组的一种方法。Liu等人重点介绍了GAP–MS（聚糖依赖性亲和纯化-质谱联用）的开发，其中细胞首先通过酶（例如PNGase F去除N-聚糖）或小分子等策略对聚糖谱进行代谢重塑，以产生确定的聚糖表型。结合选择性亲和捕获，可以富集目标糖蛋白和邻近蛋白，用于后续的LC-MS/MS鉴定。
唾液酸化是一种翻译后修饰，其特征是唾液酸添加到寡糖和糖蛋白的末端聚糖上，具有多种分子功能。MacMillan课题组开发了其μMap技术的糖靶向适应版，称为GlycoMap。GlycoMap选择性地分析唾液酸化的细胞表面糖蛋白。初始添加Ac4ManNaz促进叠氮唾液酸（SiaNAz）在细胞表面的代谢掺入。然后通过生物正交连接（例如SPAAC）将铱光催化剂募集到唾液酸化位点。应用于控制乙醇胺运输的膜受体，该方法强调了锌-受体相互作用依赖于唾液酸化，直接将特定的聚糖特征与局部互作组的变化联系起来。为了通过识别而非代谢编辑来分析唾液酸化，Wu等人利用了唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（siglecs）的聚糖特异性。通过将Siglec-9的胞外结构域与APEX2和IgG1 Fc（用于亲合力）融合，创建了一个嵌合体，可以在天然膜环境中间近标记对应受体。使用这种融合蛋白，桥粒芯糖蛋白-2（DSG2）被鉴定为Siglec-9的对应受体，说明凝集素引导的PL如何揭示糖基化定义的互作组。总之，这些方法可以在细胞和囊泡上绘制唾液酸化感知的互作组图谱。
未来展望
PL和共价化学蛋白质组学的最新进展将PTM状态转化为跨越染色质、磷酸化、泛素化和糖基化的邻域水平图谱。总之，这些方法捕获了瞬时的、环境依赖性的相互作用，并越来越多地将PTM连接与功能结果联系起来。PTMs不仅重塑互作组网络，还可以重编程小分子结合，这对治疗发现至关重要。在最近的合作工作中，Li等人证明磷酸化和N-糖基化显著调节了数百种不同蛋白质的配体结合。值得注意的是，KRAS抑制剂的活性因磷酸化状态而异。此外，来自Cravatt课题组的基于活性的蛋白质分析（ABPP）引导的共价配体可以结合反应性、PTM敏感的残基，以急性扰动复合物。这种扰动可以与邻近标记配对，将ABPP-探针靶点结合转化为可测量的PTM依赖性互作组变化。这些发现主张将PTM背景纳入靶点验证、药物设计和治疗耐药性图谱绘制。
展望未来，有四个方向值得关注。首先，体内实施——正如Takato等人使用PhoxID在活体小鼠中鉴定AMPA受体（AMPARs）邻近互作组所展示的——可以实现原位、细胞类型特异性的图谱。一个相关的未来方向是PL的跨界扩展：在哺乳动物系统之外，人们越来越关注在植物中部署PL。最近的工作概述了植物在构建体与实验设计、标记条件和蛋白质组学工作流程方面的特殊考虑。内源性生物素代谢和独特的细胞特征（例如区室化和细胞壁）等固有挑战使得扩展植物的互作组特别困难。然而，PL平台和蛋白质组学的持续发展可以实现更复杂的方法，扩展PL在植物和其他非哺乳动物系统中的动态应用。进一步的扩展超越了蛋白质-蛋白质相互作用，进入到蛋白质-核酸互作组网络，邻近标记可以捕获RNA或基因组位点邻近的蛋白质，反之亦然，可以捕获目标蛋白邻近的RNA。核酸修饰越来越被认为是重要的生物学调节信号，PL为表征修饰相关的分子互作组提供了一条途径。最近的一个例子使用基于APEX2的RNA修饰“书写者”METTL1的邻近标记，来绘制哪些因子参与RNA加工和运输。更广泛地说，新兴的模式，如细胞表面糖RNA与RNA结合蛋白的相互作用，表明糖基化修饰的核酸可以形成独特的相互作用网络，可以使用基于邻近标记的概念进行表征。其次，将PL与空间条形码或成像相关读数相结合的空间和单细胞分辨率，可以解析稀有细胞状态或异质组织中的PTM依赖性互作组。第三，共同富集或顺序分析不同的PTM可以实现PTM串扰的多重分析。研究磷酸化、乙酰化和巯基氧化之间并发相互作用的整合性全局多PTM研究表明，分层的PTM测量揭示了协调的调节。将这一范式扩展到同一样本的邻近标记，有助于量化单个邻域内的组合PTM调控。第四，PL与结构/基序网络的计算整合，将把邻近标记的“命中”转化为可预测的、基于机制的相互作用图谱。总之，这些进展将有助于进一步推动PTM感知的互作组图谱绘制从描述性图谱转向可操作的框架，将分子机制与治疗机会联系起来。
